張世杰 郎振為 王欣欣 呂福東

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科，北京 100069)

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3，GPC-3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族中的一員，一種癌胚蛋白，表達(dá)在胚胎里，發(fā)育期間，起到形態(tài)形成和生長(zhǎng)控制作用［1］。這個(gè)家族中有6個(gè)成員，從GPC1至GPC6在人體組織中已被識(shí)別，GPC-3通過(guò)糖基磷脂酰肌醇連接到細(xì)胞膜上，在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起到重要作用［2］。在胚胎和胎兒期，GPC-3的表達(dá)有明顯的器官組織特異性和分化時(shí)相特異性。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在整個(gè)孕期均有明顯表達(dá)，而嬰兒出生后到成人階段，除在胎盤、乳腺、間皮、卵巢、肺及腎組織有弱表達(dá)外，其他正常組織無(wú)明顯表達(dá)［3］。鑒此，本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)GPC-3的免疫組化在肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(in-trahepatic cholangiocarcinoma，ICC)中的表達(dá)，并結(jié)合細(xì)胞角蛋白(cytokeratin-19，CK-19)免疫組化染色的結(jié)果，探討GPC-3和CK-19聯(lián)合應(yīng)用在診斷和鑒別HCC與ICC中的價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科2009年12月至2011年3月的肝穿刺及外科手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本142例，其中HCC 94例，ICC 32例，肝細(xì)胞癌合并肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(combined hepatocellular and cholangiocarcinoma，CHC)16 例。

1.2 方法

所有標(biāo)本首先經(jīng)過(guò)10%的甲醛固定，然后切取腫瘤組織按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm連續(xù)切片，首先進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，肝癌診斷由病理專業(yè)兩位副主任醫(yī)師復(fù)診，并按 Edmondson—Steiner法，將肝癌分化程度診斷標(biāo)準(zhǔn)分為高分化、中分化、低分化各為 37、80、25 例。

1.3 免疫組化檢測(cè)

采用EnVision 2步法，上述切片經(jīng)烤片、脫蠟，逐級(jí)乙醇由高至低至入水，入3%過(guò)氧化氫液5 min，PBS緩沖液浸3遍，每遍5 min，放入pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復(fù):高壓鍋噴氣后，加熱2 min，變中火2 min，關(guān)火后燜10 min，放入冷水中冷卻至37℃，放入PBS緩沖液洗3遍，加GPC-3一抗(鼠抗人單克隆抗體)，4℃冰箱過(guò)夜，PBS緩沖液浸3遍，每遍5 min，加二抗PV6000(通用型抗體)37℃ 10 min，PBS緩沖液浸3遍，DAB顯色，PBS液終止染色，乙醇由低至高濃度逐級(jí)脫水至入二甲苯，封片。CK-19免疫組化染色步驟同GPC-3基本一樣。不同的只是CK19在高溫高壓修復(fù)后，37℃進(jìn)行1 min胃酶消化，PBS緩沖液洗3遍，加入一抗(鼠抗人單克隆抗體)，后續(xù)步驟同GPC-3。

1.4 試劑

GPC-3和CK-19兩種試劑均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.5 染色結(jié)果判斷

GPC-3呈細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)為黃色或棕黃色，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞率作為表達(dá)強(qiáng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)［4］，略微修改:分別為陰性(-)細(xì)胞陽(yáng)性率:＜10%;弱陽(yáng)性(+):細(xì)胞陽(yáng)性率10% ～30%;陽(yáng)性(++):細(xì)胞陽(yáng)性率31% ～60%;強(qiáng)陽(yáng)性(+++):細(xì)胞陽(yáng)性率＞60%。

膽管上皮細(xì)胞質(zhì)染成黃色或棕黃色為CK-19陽(yáng)性。CK-19表達(dá)強(qiáng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)同GPC-3。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行處理，分組等級(jí)資料采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和兩兩比較的擴(kuò)展t檢驗(yàn)。用Kappa系數(shù)描述實(shí)際疾病分類與預(yù)測(cè)分類的一致性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPC-3、CK-19在HCC、ICC和CHC中的表達(dá)

94例HCC中，GPC-3陽(yáng)性表達(dá)79例(84.0%)(圖1)，32例ICC中GPC-3陰性表達(dá)5例(15.6%)，16例CHC的GPC-3表達(dá)均為陽(yáng)性(100%)(圖2)，3組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 GPC-3在肝細(xì)胞肝癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及肝細(xì)胞癌合并肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)Tab.1 Expression of GPC-3 in HCC，ICC and CHC cells n(%)

CK-19在ICC及CHC組織中檢出率分別為96.6%(31/32)及100%(16/16)(圖 3，4)。在 HCC病例中均為陰性。CK-19在ICC和CHC中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

2.2 腫瘤分化程度與GPC-3和CK-19檢出及表達(dá)程度的關(guān)系

高分化的GPC-3傾向于陰性(-)和弱陽(yáng)性(+)(28.0%，56.0%)，中低分化的GPC-3傾向于強(qiáng)陽(yáng)性(++，+++)(表3)，但是，表3的結(jié)果尚不能提示不同分化程度的GPC-3分布的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。進(jìn)而分別分析HCC、ICC和CHC中分化程度和GPC-3的關(guān)系。在ICC和CHC中不同分化程度的GPC-3的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

高分化的GPC-3傾向于陰性(-)和弱陽(yáng)性(+)(25.0%，62.5%)，中低分化的 GPC-3 傾向于強(qiáng)陽(yáng)性(++，+++)，提示不同分化程度的GPC-3分布的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見(jiàn)表4。

表3 GPC-3與腫瘤分化程度的關(guān)系Tab.3 Relationship between differentiation and GPC-3 expression n(%)

表4 HCC中GPC-3與腫瘤分化程度的關(guān)系Tab.4 Relationship between the extent of differentiation and expression of GPC-3 in HCC n(%)

高分化腫瘤中CK19的陰性(-)和弱陽(yáng)性(+)的比例(100.0%)高于低分化和中分化腫瘤中的比例(83.8%，90.1%)(P＜0.05)，詳見(jiàn)表5。

表5 CK-19與腫瘤分化程度的關(guān)系Tab.5 Relationship between the extent of differentiation and CK-19 expressionn(%)

2.3 聯(lián)合應(yīng)用GPC-3和CK-19鑒別HCC、ICC 和CHC

HCC、ICC和CHC的鑒別標(biāo)準(zhǔn)為:在肝癌中GPC-3陰性或陽(yáng)性，且CK19陰性為HCC，預(yù)測(cè)例數(shù)是94例。GPC-3陰性，且CK19陽(yáng)性為ICC，預(yù)測(cè)例數(shù)是27例。GPC-3陽(yáng)性，且CK19陽(yáng)性為CHC，預(yù)測(cè)例數(shù)是21例，詳見(jiàn)表6。

實(shí)際疾病分類與預(yù)測(cè)分類的一致性相當(dāng)好(Kap-pa=0.888，P=0.000)，準(zhǔn)確率是 94.4%，詳見(jiàn)表 7。

表6 GPC-3與CK-19的關(guān)系Tab.6 Relationship between the expression of GPC-3 and CK-19 n(%)

3 討論

基于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)，肝癌被分為3類，肝細(xì)胞肝癌(HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)、肝細(xì)胞癌合并肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(CHC)。這3種肝腫瘤經(jīng)常很難區(qū)分，GPC-3是一種血清學(xué)和組織學(xué)上的肝癌標(biāo)志物［5］。GPC-3在HCC與良性肝病組織的表達(dá)差異明顯，在丙型肝炎后肝硬化背景的早期，HCC組織中GPC-3表達(dá)100%，其他良性肝病和正常肝組織中表達(dá)為0%［6］?？娸x來(lái)等［7］研究顯示:肝癌組織GPC-3陽(yáng)性表達(dá)率為81.5%，而癌旁及遠(yuǎn)肝癌組織無(wú)表達(dá)。Di Tommaso L等［8］研究顯示，GPC-3對(duì)早期肝癌診斷的敏感性是69%，特異性是91%。在AFP陰性肝癌中，GPC-3也有較高的表達(dá)率。Ding G H等［9］檢測(cè)了41例AFP陰性的肝癌組織及其癌旁組織的GPC-3 mRNA，癌組織表達(dá)率為73.17%，癌旁組織中只有9.76%，且為弱表達(dá)。

表7 實(shí)際疾病分類與預(yù)測(cè)分類的比較Tab.7 Comparison of actual disease classification and predicted disease classification

本實(shí)驗(yàn)顯示，GPC-3在肝癌細(xì)胞膜上著色，或在細(xì)胞質(zhì)中著色，一般情況是2種著色都有，很少有單一一種著色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜混合表達(dá)與生存率沒(méi)有相關(guān)性［4］。GPC-3只在肝癌細(xì)胞上著色，而正常肝細(xì)胞及膽管中極少著色;在膽管癌中，只有CK-19在膽管癌細(xì)胞及正常膽管細(xì)胞中著色，在肝癌細(xì)胞中均為陰性。在CHC中，GPC-3及CK-19均在同一部位著色，可能是HCC祖細(xì)胞或干細(xì)胞既向HCC成分轉(zhuǎn)化又向ICC成分轉(zhuǎn)化的結(jié)果［5］。GPC-3對(duì)HCC和CHC有較高敏感性和特異性，相對(duì)于ICC，其敏感性和特異性較低，GPC-3在HCC和CHC的表達(dá)與ICC有明顯差異。GPC-3多數(shù)在肝細(xì)胞成分中表達(dá)，在CHC中表達(dá)，可能與肝癌祖細(xì)胞部分向肝癌細(xì)胞成分轉(zhuǎn)化有關(guān)［5］，少數(shù)在膽管來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)。

CK-19在ICC和CHC的絕大多數(shù)病例中呈陽(yáng)性表達(dá)，而在HCC中均為陰性，表明CK-19僅表達(dá)于膽管上皮來(lái)源的細(xì)胞。在ICC和CHC中不同分化程度的GPC-3的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.327，P=0.499)。此外，高分化的腫瘤組織中GPC-3表達(dá)多為陰性和弱陽(yáng)性(25.0%，62.5%)，中低分化的 GPC-3多為強(qiáng)陽(yáng)性，反映出不同分化程度的GPC-3分布的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這與Shirakawa H等［4］報(bào)道的高分化HCC與低分化HCC相對(duì)比，GPC-3很少在高分化HCC中表達(dá)相一致。GPC-3在中低分化HCC中表達(dá)強(qiáng)度明顯高于高分化HCC。而HCC分化程度又與HCC侵襲性相關(guān)。提示，GPC-3在HCC中表達(dá)強(qiáng)度可能與HCC的惡性程度有關(guān)，可能是預(yù)后的判斷指標(biāo)。

綜上所述:聯(lián)合應(yīng)用GPC-3和CK-19在肝細(xì)胞肝癌診斷和鑒別診斷中是有一定價(jià)值的。

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