肖 引 劉 凱 陳 江 彭國(guó)華 李廣琪 陳 芳 李 勃 閆美娟

(武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，西安 710054)

參七復(fù)脈片是在古方生脈散的基礎(chǔ)上加入太白三七(tongoloa dunnii wolff)和鳳尾七(rhodiola dumulosa S.H.Fu)，同時(shí)將方中人參改成紅參而后提取加工制成的片劑。具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰保肺、抗高原反應(yīng)等功效。生長(zhǎng)在海拔2 800～3 300 m高寒、缺氧地方的鳳尾七小叢紅景天(rhodiola dumulosa S.H.Fu)和太白三七(tongoloa dunnii wolff)具有明顯的抗疲勞、抗缺氧的作用［1］。紅景天具有強(qiáng)身健體、抗缺氧、抗微波輻射及興奮大腦和脊髓神經(jīng)、抗老化、抗不良刺激、活血化瘀等功效，還可以提高體力和腦力勞動(dòng)者的工作效率、延緩機(jī)體衰老、防治老年疾病等［2-4］。

本研究采用薄層色譜法對(duì)處方中的麥冬和太白三七進(jìn)行定性鑒別;采用高效液相色譜法對(duì)鳳尾七中的紅景天苷進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行考察，建立準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法。

1 材料和方法

1.1 材料

LC-10Avp島津二元輸液泵，包括SPD-M10Avp島津二極管陣列檢測(cè)器、AS-300tsp自動(dòng)進(jìn)樣儀、CLASS-vp 6.1色譜工作站(日本島津公司)。

麥冬對(duì)照藥材:購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):1013-9702);鳳尾七藥材和太白三七藥材:購(gòu)自太白縣藥材公司;紅景天苷:購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):110818-200404);參七復(fù)脈片(批號(hào):090401、090402、090403)，由西安新通藥物研究有限公司中試車間生產(chǎn)，所有藥材都經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院中藥化學(xué)室主任宋小妹教授鑒定;甲醇為色譜純，水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 薄層色譜法鑒別

取太白三七20片，除去包衣研細(xì)，稱取細(xì)粉約5 g加水10 mL，置分液漏斗中，第1次加水20 mL，第2、3次各加水10 mL，萃取液依次用水洗滌2次，每次2 mL，揮去乙醚殘?jiān)蛹状级ㄈ? mL，作為供試品溶液;取太白三七藥材1 g，加氯仿20 mL回流10 min，蒸干濾液，殘?jiān)蛹状级ㄈ? mL，作為對(duì)照藥材溶液;按處方比例稱取缺太白三七的藥材，依照工藝制備陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。依照薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)［5］，吸取上述陰性對(duì)照溶液、供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上。以環(huán)己烷-乙酸乙酯(7∶3)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。

取麥冬20片，除去包衣研細(xì)，稱取細(xì)粉約5 g加水10 mL搖勻，加入2 mol/L的鹽酸溶液5 mL搖勻，置水浴上濃縮至近干，加水10 mL轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加氯仿5 mL振搖，靜置至分層。分取氯仿層，置水浴上濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。取麥冬對(duì)照藥材約1 g加水20 mL，煎煮10 min過(guò)濾。濾液濃縮至5 mL加入2 mol/L的鹽酸2.5 mL搖勻，置水浴上濃縮至近干。殘?jiān)铀? mL，置分液漏斗，加氯仿5 mL振搖，靜置至分層收集氯仿層，置水浴上濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。取處方比例量稱取缺麥冬的藥材，依照工藝制備陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法，吸取上述陰性對(duì)照溶液、供試品溶液和對(duì)照藥材溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上。以甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12∶4∶0.5)為展開(kāi)劑，置紫外光燈365 nm下觀察。

1.2.2 含量測(cè)定

1)色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性:色譜柱采用Kromasil C18(4.6 mm ×150 mm)，流動(dòng)相為甲醇-水(15∶85)，檢測(cè)波長(zhǎng)λ=270 nm，流速為1 mL/min，柱溫30℃，理論板數(shù)按紅景天苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。

2)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取紅景天苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mL含50 μg的溶液，搖勻即得。

3)供試品溶液的制備:取本品細(xì)粉約10 g，精密稱定置分液漏斗中，加水20 mL，乙醚提取5次，每次10 mL，合并乙醚液，用水洗滌2次，每次10 mL，水冼液再用乙醚10 mL提取1次，合并乙醚液揮干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，分次轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中。加甲醇至刻度搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

4)陰性樣品溶液:按處方比例稱取除去鳳尾七的藥材適量，依照參七復(fù)脈片的制備工藝制得陰性樣品，照“3)”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

5)線性關(guān)系考察:精密吸取紅景天苷對(duì)照品溶液(518.0 mg/L)1、2、3、4、5、6、7 μL，進(jìn)行 HPLC 測(cè)定，記錄色譜圖;以標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣量(X)對(duì)色譜峰面積積分值(Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。

6)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得紅景天苷峰面積。取同一樣品，按供試品溶液制備方法制備后，分別于0、1、2、3、4 h進(jìn)樣檢測(cè)一次，測(cè)得紅景天苷峰面積。精密稱取同一批號(hào)(090401)樣品6份，按供試品溶液的制備方法制備后，進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定，測(cè)得紅景天苷峰面積。

7)加樣回收率試驗(yàn):精密取已知含量的同批號(hào)樣品6份，每份約5 g，分別加入已知紅景天苷含量的80%、100%、120%紅景天苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備后，進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄紅景天苷峰面積積分值。

8)樣品含量測(cè)定:取樣品3批，照供試品溶液的制備方法制備，測(cè)定紅景天苷含量。

2 結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別結(jié)果

太白三七供試品與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，呈現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照不顯斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 太白三七的TLC鑒別Fig.1 The TLC identify of tongoloa dunnii wolff

麥冬供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照不顯斑點(diǎn)。

2.2 樣本測(cè)定結(jié)果

經(jīng)計(jì)算回歸方程 Y=175 066 0.507 4X-4 887.857 1，r2=0.999 8。以上結(jié)果表明，紅景天苷進(jìn)樣量在0.518～3.626 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)得出紅景天苷峰平均峰面積為460 170，RSD值為0.61%。表明儀器精密度和操作精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)得出紅景天苷峰平均峰面積為424 364，RSD值為0.70%，表明供試品溶液在4 h之內(nèi)基本穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果得出紅景天苷峰平均峰面積RSD值為1.67%，表明此方法重復(fù)性良好。

根據(jù)紅景天苷峰面積積分值計(jì)算紅景天苷的含量，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖2 麥冬的TLC鑒別Fig.2 TLC Identify of ophiopogon japonicus

表1 紅景天苷的回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of recovery rate of salidroside

樣品測(cè)定結(jié)果表明，參七復(fù)脈片每片含紅景天苷在2.16～2.84 mg之間，根據(jù)測(cè)定結(jié)果規(guī)定本品每片含紅景天苷不得低于2.0 mg，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of sample determination

3 討論

參七復(fù)脈片對(duì)因高原缺氧伴有心陽(yáng)不振、疲勞、心肌缺血的患者具有很好的療效。其中鳳尾七還具有滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)心安神、明目的功能，在民間用此藥治療鼻出血、便血和高血壓等［6］效果較好。目前，有學(xué)者［7］采用高效液相色譜法測(cè)定太白三七中三七總皂苷的含量，對(duì)其有效成分含量測(cè)定有一定的參考價(jià)值。麥冬薄層鑒別常以三氯甲烷-丙酮(4∶1)為展開(kāi)劑［8］。本文在藥典的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(7∶3)為展開(kāi)劑展開(kāi)鑒別太白三七，以甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12∶4∶0.5)為展開(kāi)劑鑒別麥冬，方法簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)。

本研究為參七復(fù)脈片中太白三七和麥冬的薄層鑒別提供依據(jù)。同時(shí)本文以鳳尾七中的紅景天苷為定量指標(biāo)，采用HPLC的方法進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)其波長(zhǎng)、流動(dòng)相進(jìn)行選擇優(yōu)化最終選定了在1.2.2項(xiàng)下的條件，所得到的供試品溶液色譜圖中紅景天苷峰形良好，與其他雜質(zhì)分離度好，方法學(xué)各項(xiàng)參數(shù)能滿足HPLC的相關(guān)要求，可作為參七復(fù)脈片的質(zhì)量控制方法。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊(cè))［M］.上海:上海人民出版杜，1977:487.

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［3］曲智威.紅景天的研究進(jìn)展［J］.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2005，18(7):1063-1066.

［4］龍怡，李佳川，孟憲麗，等.紅景天有效成分對(duì)缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2010，10(1):24-25.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:3-5.

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