郭 偉 宋珊珊 田 琳 高 艾 牛丕業(yè) 左 昕 朱鐘慧 吳惠慧

(首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100069)

多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶〔poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1〕是一種重要的DNA修復(fù)基因，在DNA的損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用［1-2］。當(dāng)PARP-1發(fā)生損傷時(shí)無法行使其修復(fù)功能，使DNA損傷無法修復(fù)或發(fā)生錯(cuò)誤修復(fù)，是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的原因之一［3-5］。本研究利用 RNAi(RNA interferencing，RNAi)技術(shù)，構(gòu)建PARP-1低表達(dá)的石英惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮細(xì)胞(M-16HBE)模型，為進(jìn)一步研究parp-1基因的功能和作用機(jī)制提供細(xì)胞模型［6-7］。

1 材料和方法

1.1 材料

M-16HBE(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建);表達(dá)PARP-1 siRNA的載體質(zhì)粒4種:分別為陰性質(zhì)粒(P-0)和3種陽性質(zhì)粒(P-1、P-2、P-3)(Invitrogen 公司，美國);MEM 培養(yǎng)基(Gibco公司，美國);胎牛血清(Gibco公司，美國);Blasticidin S HCL(Invitrogen公司，美國);質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omego公司，美國);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectami-neTM2000(Invitrogen公司，美國);Trizol(Invitrogen公司，美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司，立陶宛);PCR反應(yīng)試劑盒(Fermentas公司，立陶宛);MTT(Solarbio公司，美國);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Solarbio 公司，美國);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司，日本);倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本);凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD公司，美國);核酸蛋白質(zhì)分析儀(Bio-RAD公司，美國);PCR儀(Applied Biosytems公司，美國);酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

M-16HBE細(xì)胞按2.5×105/瓶的密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清和100 mg/L慶大霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔日換液，3～4 d傳代1次;0.25%的胰蛋白酶消化;置于37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增及提取

取4只30 mL的無菌試管，分別裝入5 mL LB培養(yǎng)基，加入抗生素后混勻備用;分別取經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)陰性質(zhì)粒(P-0)、3種陽性質(zhì)粒(P-1，P-2，P-3)的大腸肝菌于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h。提取質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的完整性，并測(cè)定其濃度和吸光度。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M-16HBE細(xì)胞接種到6孔板中，接種密度為2×106/孔;37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染前熒光顯微鏡下拍照。步驟如下:① 取脂質(zhì)體LipofectamineTM2000共16 μL加234 μL無血清的MEM置于無菌Eppendorf管中，混勻后室溫放置5 min;②分別取4種質(zhì)粒DNA(P-0、P-1、P-2、P-3)4 μg 加入 250 μL 無血清的 MEM 置于另一個(gè)無菌Eppendorf管中，混勻后室溫放置5 min;③將上述兩Eppendorf管中的液體合并(約0.5 mL)，混勻后室溫放置20 min;④用PBS洗6孔板3次，然后每孔加入1.5 mL無血清無抗生素的MEM，將③中0.5 mL的混合液加入到6孔板中(每組設(shè)3個(gè)平行)，空白對(duì)照組只加2.0 mL無血清無抗生素的MEM，6 h后更換為含10%胎牛血清但無抗生素的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡下拍照。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆化培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P-0、P-1、P-2、P-3)分別進(jìn)行 1∶6 傳代培養(yǎng)于6孔板中，12 h后更換培養(yǎng)液，每孔加含8 μg/mL Blasticidin S HCL的培養(yǎng)基2 mL，每3 d換液1次，7 d左右即已形成克隆。熒光顯微鏡下將發(fā)光克隆進(jìn)行標(biāo)記，挑取發(fā)光克隆于96孔板中，每個(gè)克隆一孔;待96孔板中的細(xì)胞融合后，移入6孔板中繼續(xù)用含Blasticidin S HCL的培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取熒光最亮的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，大量?jī)龃婧髠溆谩?/p>

1.2.5parp-1基因的 mRNA 表達(dá)

1)RNA的提取:用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并測(cè)定RNA的濃度和吸光度。

2)cDNA的合成:PCR管中依次加入:RNA 1 μg，Oligo(dT)18 Primer 1 μL，DEPC 水加至 12 μL，輕微震蕩混勻，70℃ 5 min，4℃冷卻;加入5×Reaction buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP mix 2 μL，20 U/μL RNA酶抑制劑 1 μL，輕彈混勻，37 ℃，5 min，4 ℃冷卻;加入200 U/μL 反轉(zhuǎn)錄酶 M-MuLV 1 μL，輕彈混勻，42℃，60 min，70 ℃，10 min，4 ℃冷卻完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);合成的cDNA置于-20℃保存。

3)RT-PCR反應(yīng)以cDNA為模板，擴(kuò)增parp-1基因，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。parp-1引物序列為:5'-CCCAGGGTCTTCGGATAG-3'(上游引物)，5'-AGCGTGCTTCAGTTCATACA-3'(下游引物);β-actin引物序列為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'(上游引物)，5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'(下游引物)。引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。分別取β-actin和parp-1上下游引物各1 μL，加入18 μL純水，待用。反應(yīng)總體系為 20 μL:SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA 模板 1.6 μL，上述稀釋好的引物2 μL;ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:95℃，7 min;變性:95 ℃，10 s;退火/延伸:60 ℃，1 min;40個(gè)循環(huán);最終延伸:60℃，1 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析:100 V，40 min;電泳結(jié)束后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算parp-1的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算抑制率。

1.2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增生活性

將M-16HBE細(xì)胞、陰性對(duì)照組和干擾組P-3細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/mL，0.2 mL/孔接種于96孔板，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，分別常規(guī)培養(yǎng) 12、24、36、48、60、72 h，每 48 h換液1次;終止培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次，每孔加100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，在37℃、5%CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去上清，每孔加100 μL DMSO，37 ℃振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M-16HBE細(xì)胞、陰性對(duì)照組和干擾組P-3細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS清洗兩次后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取0.5 mL單細(xì)胞懸液加入5 mL 4℃預(yù)冷的70%乙醇中，充分混勻后用封口膜封口，4℃固定過夜;1 000 r/min離心10 min去上清，用PBS洗2次后轉(zhuǎn)移到1.5 mL的 Eppendorf管中，加入1 mL 0.00 2%的RNase-A溶液，37℃水浴30 min，冷卻至室溫;加入0.1 mL 0.05%的PI染液，室溫孵育10 min后，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞周期各期的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)間的比較用ANOVA法，多重比較用 LSD，率的比較用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M-16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率觀察

質(zhì)粒載體中含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)，倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，熒光表達(dá)較強(qiáng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為60%以上(圖1)。細(xì)胞1∶6傳代后，抗生素篩選至7 d時(shí)已形成較大克隆(圖2)。

圖1 EGFP標(biāo)記的siRNA在M-16HBE中的表達(dá)Fig.1 Expression of siRNA with EGFP labeling in M-16HBE cell(100×)

2.2 轉(zhuǎn)染后M-16HBE的parp-1基因mRNA表達(dá)

parp-1和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果詳見圖3，parp-1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量及抑制率詳見表1。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，parp-1基因的mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);干擾組P-1的抑制率(7.95%)與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);干擾組 P-2 的抑制率(32.21%)、干擾組P-3的抑制率(55.56%)分別與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.002、0.001)。

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞7 d時(shí)形成的克隆Fig.2 Cloning of the formation of transfected cell on the 7th day(200×)

圖3 parp-1和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of parp-1 and β-actin amplified products

表1 parp-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量及抑制率Tab.1 Relative band density of parp-1 gene mRNA and rate of inhibition(±s)(n=3)

表1 parp-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量及抑制率Tab.1 Relative band density of parp-1 gene mRNA and rate of inhibition(±s)(n=3)

*P ＜0.05 vs control;parp-1:poly(ADP-ribose)polymerase-1.

Group Relative band density Rate of inhibition/%Control 0.981 ±0.008 Negative control 0.971 ±0.005 1.02 ±0.51 Transfection P-1 0.903 ±0.003 7.95 ±0.31 Transfection P-2 0.665 ±0.002* 32.21 ±0.20*Transfection P-3 0.436 ±0.002* 55.56 ±0.20*

2.3 細(xì)胞增生活性變化情況

隨著時(shí)間的變化，M-16HBE細(xì)胞、陰性對(duì)照組和干擾組P-3細(xì)胞均不斷增生;從36 h開始，干擾組P-3細(xì)胞的增生能力顯著高于對(duì)照組(P值分別為0.043、0.031、0.033、0.026)(表2，圖4)。

表2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增生情況Tab.2 The proliferation of cells after transfected with siRNA(±s)A(n=3)

表2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增生情況Tab.2 The proliferation of cells after transfected with siRNA(±s)A(n=3)

siRNA:small interfering RNA;* P ＜0.05 vs control.

Time/h Control Negative control Transfection P-3 12 0.112 ±0.039 0.117 ±0.010 0.115 ±0.013 24 0.177 ±0.017 0.183 ±0.013 0.188 ±0.025 36 0.224 ±0.018 0.222 ±0.026 0.259 ±0.045*48 0.210 ±0.030 0.220 ±0.035 0.270 ±0.021*60 0.220 ±0.013 0.225 ±0.014 0.280 ±0.020*72 0.267 ±0.023 0.270 ±0.031 0.342 ±0.019*

圖4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增生情況Fig.4 The proliferation of cells after being transfected with siRNA

2.4 細(xì)胞周期變化情況

干擾組P-3與對(duì)照組相比，S期細(xì)胞比例升高了7.8%，G2期細(xì)胞比例下降了5.8%，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.002、0.005);而G1期細(xì)胞無明顯變化，詳見圖5。

3 討論

RNAi可抑制某一特定基因的表達(dá)［8］，自其被發(fā)現(xiàn)以來［9］，廣泛應(yīng)用于基因的功能、基因組學(xué)、基因治療、信號(hào)傳導(dǎo)通路等研究中。RNAi主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，所以也被稱為序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)［9］。Ting A H等［10］用siRNA靶向干擾延伸因子(elongation factor，EF1)啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)其下游基因沉默。

RNAi的作用機(jī)制主要是通過RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer的作用，在體內(nèi)切割產(chǎn)生或者外界導(dǎo)入 dsRNA(double-stranded RNA，dsRNA)，從而產(chǎn)生有活性的siRNA，介導(dǎo)與目的基因互補(bǔ)同源mRNA的特異性降解，從而阻斷目的基因的表達(dá)并導(dǎo)致其沉默。siRNA介導(dǎo)RNAi的效能取決于siRNA的有效性、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞種類以及目的基因的蛋白更新速度等多種因素。體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體，有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，發(fā)揮長(zhǎng)期阻抑基因表達(dá)的作用。21～23 nt長(zhǎng)度的dsRNA作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以造成對(duì)目的基因的特異性抑制。

本研究選取siRNA表達(dá)載體的方法，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染M-16HBE細(xì)胞，所用的siRNA表達(dá)載體首先根據(jù)GenBank提供的parp-1基因序列，按siRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)目的siRNA序列;同時(shí)設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照序列，經(jīng)BLAST比對(duì)分析與人類其他基因序列無同源性;構(gòu)建載體質(zhì)粒4種:分別為陰性質(zhì)粒1種和陽性質(zhì)粒3種。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后用反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)目的基因parp-1的mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示陽性質(zhì)粒干擾組P-3的抑制率為55.56%，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)parp-1基因的表達(dá)抑制效果最為明顯。

PARP-1廣泛地存在于多數(shù)真核細(xì)胞中，是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，在DNA復(fù)制、細(xì)胞增生分化調(diào)控、基因組的穩(wěn)定等多方面發(fā)揮著重要的作用。本課題組運(yùn)用RNAi技術(shù)沉默parp-1基因后，隨著時(shí)間的變化，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不斷增生，且與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞增生明顯加快;轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞周期與對(duì)照組相比發(fā)生改變:S期細(xì)胞比例升高了7.8%，G2期細(xì)胞比例下降了5.8%，說明沉默parp-1基因后，parp-1對(duì)基因組的修復(fù)能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞增生加快，細(xì)胞呈現(xiàn)惡性生長(zhǎng)與增生，parp-1基因參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與增生。

圖5 parp-1基因低表達(dá)對(duì)M-16HBE細(xì)胞周期的影響Fig.5 The effect of parp-1 gene low expression on the M-16HBE cell cycle

綜上所述，parp-1基因低表達(dá)M-16HBE模型構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究parp-1基因在石英致癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

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