董洪武 郭彩霞 杜鳳和 王紅霞 曾翔俊 張立克 田俊萍

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院北京石景山醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100043;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，北京 100069)

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是指在缺血基礎(chǔ)上，恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象，其機(jī)制涉及自由基的作用、鈣超載和白細(xì)胞的作用。對(duì)急性心肌梗死和再灌注損傷心臟的保護(hù)是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［1］，心肌I/R損傷時(shí)，會(huì)調(diào)動(dòng)心臟自身的保護(hù)機(jī)制，內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放尤其被關(guān)注。近年來，糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycation end-products，AGEs)與心血管疾病的關(guān)系也越來越受到重視，其可能參與了心臟的I/R 病理生理過程［2-3］。

糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycated end product，RAGE)是免疫球蛋白超家族的跨膜受體，它可以與多種配體結(jié)合，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，例如增加黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等［4］。RAGE有多種變異體，其中一類是可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)，循環(huán)在體液中。目前，sRAGE的合成機(jī)制有2種:一是可變剪切的pre-mRNA片段，表達(dá)后產(chǎn)生的內(nèi)源性分泌型sRAGE(endogenous secretory RAGE，esRAGE)，它的C2區(qū)表達(dá)一段特異的氨基酸序列，可被特異的抗體識(shí)別;一是金屬蛋白酶(ADAM-10，MMPs)作用于 RAGE的胞外段產(chǎn)生的 cs-RAGE［5-6］。其中，esRAGE、csRAGE 具有“誘餌”結(jié)合配體的作用，nsRAGE作用尚不明確。生理狀態(tài)下，RAGE通常是低水平表達(dá)，在應(yīng)激和損傷的部位，可以高水平表達(dá)，RAGE普遍存在于上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管細(xì)胞、炎性反應(yīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等細(xì)胞中［7-8］。Bucciarelli L G 等［2］報(bào)道，SD 大鼠 I/R 實(shí)驗(yàn)連續(xù)給予sRAGE(500 μg/d)3 d后，大鼠左室舒張壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)明顯升高，而心肌乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)明顯減少，提示sRAGE可能具有拮抗心臟的I/R損傷的作用，但I(xiàn)/R過程中sRAGE含量的變化并不清楚。

本研究通過觀察心臟缺血/再灌注大鼠血清及缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中sRAGE含量的變化，了解缺血/再灌注對(duì)內(nèi)源性sRAGE的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

BL-420生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Sigma公司)，深低溫冰箱(日本Sanyo公司)，超速低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)及膠原酶Ⅰ、Ⅱ(美國Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 在體大鼠缺血/再灌注損傷模型的復(fù)制與分組

實(shí)驗(yàn)采用250～300 g健康SD大鼠(維通利華公司提供，SCXK:京 2006-0009)，20%烏拉坦(每100 g 0.5 mL)腹腔注射麻醉。開胸，在主動(dòng)脈根部結(jié)扎和松開冠狀動(dòng)脈左前降支，采用缺血45 min后再灌注180 min復(fù)制缺血/再灌注大鼠模型［9］。經(jīng)頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室腔內(nèi)，接壓力換能器并輸入計(jì)算機(jī)，持續(xù)監(jiān)測(cè)缺血/再灌注期間心臟功能各項(xiàng)指標(biāo)的變化:心率(heart rate，HR);左室收縮末壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP);收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大變化速率(+LVdp/dtmax);舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大變化速率(-LVdp/dtmax)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為I/R組(n=19，4只左心室插管失敗;1只在缺血45 min結(jié)束時(shí)死亡，2只在再灌注60 min前死亡，1只在再灌注60 min前死亡，1只在再灌注120 min前死亡，2只在再灌注180 min前死亡)及sham組(n=6，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，動(dòng)物無死亡)，后者開胸后僅于主動(dòng)脈根部置線但不結(jié)扎，觀察225 min。

I/R組分別于缺血前10 min(BI-10)、缺血45 min(I-45)、再灌注 60 min(R-60)、120 min(R-120)及180 min(R-180)抽取靜脈血1 mL。Sham組于上述相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取血。血液經(jīng)肝素抗凝、離心后留取上清液保存于-40℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫方法測(cè)定sRAGE(sRAGE試劑盒由北京愛迪博生物科技有限公司提供)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，再次結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，從右頸動(dòng)脈注入1%伊文藍(lán)，并將心臟取下，采用TTC染色方式測(cè)定心肌梗死范圍，采用Image-pro plus圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量左心室面積(area of left ventricle，LV)，缺血面積(area at risk，AAR，)與梗死面積(infarction size，IS)，分別計(jì)算缺血面積(×100%)和梗死面積

1.2.2 培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型

出生48 h內(nèi)的SD乳鼠(維通利華公司提供)心肌細(xì)胞被接種在35 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(1×105細(xì)胞/孔)，含10%胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，換用含1%胎牛血清的DMEM;培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組給予缺氧3 h(H)或缺氧3 h/復(fù)氧2 h(H/R)的刺激;對(duì)照組(control)一直保存在培養(yǎng)箱中，處于常氧狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組培養(yǎng)基，采用的酶聯(lián)免疫方法測(cè)定sRAGE;采用比色法檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2個(gè)獨(dú)立樣本的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用LSD(least significant difference)進(jìn)一步檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體大鼠心功能變化

Sham組不同時(shí)間點(diǎn)的左室心功能參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與sham組相比，I/R組缺血前10 min(BI-10)左室功能參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，缺血45 min(I-45)、再灌注60 min(R-60)、再灌注120 min(R-120)和再灌注180 min(R-180)左室功能參數(shù)均明顯降低，HR平均降低了11.73%，LVESP平均降低了 8.44%，+LVdp/dtmax平均降低了 28.51%，-LVdp/dtmax平均降低了21.43%。提示I/R損傷模型復(fù)制成功(表1，2)。

2.2 在體大鼠心肌梗死面積變化

缺血/再灌注后缺血面積為57.97% ±15.36%，梗死面積為32.33% ±12.38%，支持缺血/再灌注損傷模型復(fù)制成功。

2.3 在體大鼠血清sRAGE含量的變化

與 BI-10相比，I/R 組 I-45、R-60、R-120、R-180 的血漿sRAGE含量均明顯下降(BI-10:1.221±0.883;I-45:0.842 ± 0.426;R-60:0.612 ± 0.245;R-120:0.650 ±0.372;R-180:0.641 ±0.322)，分別降低 31.04%、49.88%、46.76%和47.50%;與 I-45 相比，盡管R-60，R-120，R-180的sRAGE含量有降低的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

表1 Sham組不同時(shí)點(diǎn)的左室功能參數(shù)Tab.1 Left ventricular function at different time points in sham group

表2 I/R組不同時(shí)點(diǎn)的左室功能參數(shù)Tab.2 Left ventricular function at different time points in I/R group

2.4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH活力的變化

與control組相比，H組培養(yǎng)基中的LDH活力顯著升高，H/R組培養(yǎng)基中的LDH活力亦顯著升高(Control:210.73 ± 68.64;H:281.12 ± 22.18;H/R:333.12±27.73);提示H模型和H/R模型復(fù)制成功。

2.5 心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中sRAGE含量的變化

與control組相比較，盡管H組及H/R組sRAGE含量均有降低的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(control:0.78 ±0.17;H:0.73 ± 0.10;H/R:0.73 ± 0.21;P＞0.05，圖3)。

3 討論

sRAGE的研究在心血管疾病的研究中尚處于初期階段，在臨床冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱心臟病)患者中，血漿sRAGE的含量升高還是降低，結(jié)論尚不一致。Falcone C等［4］報(bào)道非糖尿病的男性患者(328例)，經(jīng)CAG證實(shí)存在CAD，與年齡匹配的健康人(328例)相比較，其血漿sRAGE含量顯著降低。李遠(yuǎn)征等［10］報(bào)道，冠心病合并糖尿病組(48例)的esRAGE含量顯著低于單純冠心病組(52例)和正常對(duì)照組(35例)，單純冠心病組的esRAGE顯著低于正常對(duì)照組。本研究組前期工作［11］發(fā)現(xiàn)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影檢查的患者，冠心病急性心肌梗死組(16例)的sRAGE、esRAGE、cRAGE含量高于冠心病非心肌梗死組(22例)和非冠心病組(16例)，而冠心病非心肌梗死組與非冠心病組各參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)［12］報(bào)道，缺血性心力衰竭患者(72例)的sRAGE含量高于非缺血性心力衰竭患者(31例)。臨床患者所患疾病復(fù)雜，同一患者可能存在多種疾病，而每一種疾病都有可能影響到sRAGE的代謝，從而使最終結(jié)果出現(xiàn)多樣化。

在本實(shí)驗(yàn)中，與sham組相比較，I/R組的左室功能參數(shù)下降，并出現(xiàn)心肌梗死，表明I/R損傷模型復(fù)制成功。在I/R組內(nèi)，心肌細(xì)胞的缺血期和再灌注期，血漿sRAGE含量均較缺血前下降，并且再灌注期的sRAGE含量要低于缺血期。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Falcone C等［4］的臨床研究結(jié)果相似。支持 sRAGE水平降低可能與I/R損傷有關(guān)。鑒于炎性反應(yīng)導(dǎo)致的微血管及心肌組織的損傷是缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制之一;Bucciarelli L G等［2］研究發(fā)現(xiàn)在體大鼠心臟遭受I/R損傷過程中，外源性sRAGE具有抑制損傷的作用;外源性給予sRAGE可能抑制AGEs-RAGE誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，具有拮抗動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用［10］;內(nèi)源性sRAGE是否通過抗炎而保護(hù)心肌?缺血/再灌注損傷時(shí)內(nèi)源性sRAGE降低是否導(dǎo)致抗炎能力降低而致心肌受損?均值得進(jìn)一步探討。

心臟由心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等組成。血漿sRAGE含量的改變是由何種細(xì)胞受損所致?也值得探討。本研究組以離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型為對(duì)象，重點(diǎn)觀察心肌細(xì)胞sRAGE改變。本研究發(fā)現(xiàn)，H組及H/R組與control組相比LDH活力顯著升高，提示缺氧及缺氧/復(fù)氧模型復(fù)制成功，但3組間sRAGE差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不支持整體實(shí)驗(yàn) I/R組血漿sRAGE降低系心肌源性改變。換言之，內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞源性sRAGE改變可能是致心臟缺血/再灌注損傷病因的作用靶點(diǎn)。

缺血及再灌注是否通過下調(diào)內(nèi)皮等細(xì)胞源性sRAGE，通過炎性反應(yīng)增加而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷?尚需進(jìn)一步探討。

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