馬亞紅 冼勛德 楊俊芬 甄亞平 劉國(guó)慶 楊金奎

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730;2.北京市普仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100062;3.北京大學(xué)心血管研究所教育部分子心血管學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029;4.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)中心，北京 100069)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)常伴有血漿三酰甘油(triglyceride，TG)增高和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)降低。而HDL降低已經(jīng)通過研究［1］證實(shí)為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)(以下簡(jiǎn)稱冠心病)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。在HDL亞組分中，大而密度低的顆粒(HDL2a、HDL2b及HDL3a)與CHD的發(fā)生和嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，但小而密度高的顆粒(HDL3b及HDL3c)與 CHD 的發(fā)生和嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［2-3］。國(guó)外研究［4-5］證明，與 HDL 相比，HDL2b 與 CHD 的負(fù)相關(guān)性更加顯著。長(zhǎng)期以來，由于缺乏快速可靠測(cè)定高密度脂蛋白亞組分的方法，T2DM患者HDL2b與10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系未見報(bào)道。本研究采用一種新近研發(fā)的微流芯片技術(shù)［5］測(cè)定空腹血清HDL、HDL2b、HDL2b/HDL比率，通過分析其與10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(10-year CHD risk)的關(guān)系，進(jìn)一步揭示T2DM脂代謝紊亂的特點(diǎn)及其意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

所有研究對(duì)象均來源于北京社區(qū)人群糖尿病前期(Beijing community pre-diabetes，BCPD)研究項(xiàng)目。BCPD研究以北京社區(qū)人群為基礎(chǔ)，進(jìn)行糖尿病遺傳學(xué)及臨床研究。于2007年5～11月在北京市順義區(qū)南法信鎮(zhèn)對(duì)35～74歲自然人群進(jìn)行體檢。對(duì)所有現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查人員進(jìn)行培訓(xùn)，采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的調(diào)查問卷和體檢表，考核合格后進(jìn)行調(diào)查。所有參加體檢居民簽署知情同意書。35～74歲居民9 033名，參加體檢3 457名，應(yīng)答率為38.3%。其中，不合格調(diào)查對(duì)象(數(shù)據(jù)缺失或數(shù)據(jù)的記錄錯(cuò)誤)共163名，調(diào)查合格率為95.3%。

1)納入標(biāo)準(zhǔn):① T2DM患者均符合1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］;② 空腹血糖正常(normal fasting glucose，NFG)符合空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)＜5.6 mmol/L。

2)排除標(biāo)準(zhǔn):① 有CHD史;②體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)≥ 25 kg/m2或 ＜18 kg/m2;③ TG ＞4.52 mmol/L;④曾使用他汀類或貝特類降脂藥物治療。

1.2 研究方法

1)人體測(cè)量:包括身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍、血壓。計(jì)算BMI及腰臀比(waist hip rate，WHR)。

2)標(biāo)本采集:清晨8～9點(diǎn)鐘采空腹(禁食12～14 h 后)靜脈血5 mL，離心(3 000 r/min，15 min)，取血清分別置于2試管中，一份立即于化驗(yàn)室檢測(cè)FPG、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)，空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，一份保存于-80℃用于測(cè)定HDL、HDL2b、HDL2b/HDL 比率。

3)標(biāo)本檢測(cè):①FPG采用葡萄糖氧化酶法測(cè)量、TC采用膽固醇氧化酶法測(cè)量、TG采用去游離甘油的甘油激酶法測(cè)量、LDL采用化學(xué)沉淀法測(cè)量、ALT采用速率法測(cè)量、Cr采用苦味酸法(Beckman-Unicel Dxc800生化分析儀，美國(guó)Beckman公司)測(cè)量。② FINS采用化學(xué)發(fā)光法(IMMULITE1000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，美國(guó)DPC公司)測(cè)量。③ HDL、HDL2b、HDL2b/HDL比率采用微流芯片法(Agilent 2100生化分析儀，美國(guó)Agilent公司)測(cè)量。2 μL血清經(jīng)含熒光染料的稀釋緩沖液稀釋后上樣到芯片的樣品孔中。1張芯片可以上9個(gè)樣品。30 min左右完成對(duì)9個(gè)樣品的連續(xù)分離分析工作。④胰島素敏感性采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素敏感指數(shù)(homeostasis model for insulin resistance，HOMA-IS)進(jìn)行評(píng)估，即:20×FINs/(FPG-3.5);胰島素抵抗程度采用穩(wěn)態(tài)模式胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistant index，HOMA-IR)進(jìn)行評(píng)估，即:HOMA-IR=(FPG ×Fins)/22.5。

4)10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)計(jì)分采用1998年Wilson P W等［7］研究中使用的 Chol計(jì)分法，根據(jù)性別、年齡、血壓、糖尿病史、吸煙史、TC、LDL-C、HDL-C分層計(jì)分，并用所得到的10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，資料正態(tài)分布，方差齊性，均數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。臀圍、WHR、FPG、INS、HOMA-IS、HOMA-IR、TG、ALT呈偏態(tài)分布，以M(QR)表示，M為中位數(shù)，QR為第3與第1的四分位數(shù)間距。臀圍、WHR、FPG，用秩和檢驗(yàn)，經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，INS、HOMA-IS、HOMA-IR、TG、ALT 呈正態(tài)分布，用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HDL2b與其他危險(xiǎn)因素相關(guān)性使用 Spearman 相關(guān)分析，INS、HOMA-IS、HOMA-IR、TG使用經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，F(xiàn)PG使用經(jīng)倒數(shù)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM與NFG組臨床特征比較

3 294 名調(diào)查合格對(duì)象中，男性1 063(32.3%)，女性 2 231 名(67.7%)，男女比例為 1∶2.1;調(diào)查對(duì)象平均年齡(52.5±9.5)歲。有T2DM 病史者285人，經(jīng)OGTT試驗(yàn)符合1999年WHO對(duì)T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)者214人。初次篩查空腹血糖＜5.6 mmol/L診斷為NFG。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共有符合入選標(biāo)準(zhǔn)的T2DM患者41例;以性別及年齡分層，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取與T2DM組性別及年齡匹配NFG對(duì)照者41例。

T2DM組與NFG組比較，2組研究對(duì)象的年齡、性別、身高、BMI、腰圍、臀圍、收縮壓、舒張壓差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著高于NFG組(P＜0.01)(表1)。

表1 T2DM與NFG組臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between T2DM and controls (n=4)

2.2 T2DM與NFG組血清學(xué)檢查比較

T2DM 組患者 FBG、HOMA-IS、HOMA-IR、TG、TC均顯著高于 NFG組(P＜0.05)。應(yīng)用 Agilent公司2100生化分析儀及微流芯片，本研究分析了2組的血清HDL2b濃度及其HDL2b/HDL比率。結(jié)果顯示，T2DM組的HDL、HDL2b、HDL2b/HDL比率顯著低于NFG組(P＜0.01)。圖1A為T2DM患者以微流芯片分離的HDL亞組分代表圖形。與NFG組(圖1)相比，HDL2b的峰形明顯減小(表2、圖1)。

2.3 HDL、HDL2b、HDL2b/HDL 比率與其他因素的相關(guān)性

HDL2b與 FPG、FINS、TG、TC、HOMA-IR、10 年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān);與HDL、HDL2b/HDL比率呈正相關(guān)。而HDL2b與FPG相關(guān)性優(yōu)于HDL(r=-0.25vs-0.13)，與10年 CHD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性也優(yōu)于 HDL(r=-0.57vs-0.48)(表3)。

表2 T2DM與NFG組血清學(xué)檢查比較Tab.2 Comparison of serological testing between T2DM and controls

3 討論

HDL是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程的關(guān)鍵成分，還具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡及抗血栓形成作用［8］。HDL亞組分按照密度、顆粒大小分為5類，由大至小分別為 HDL2b、HDL2a、HDL3a、HDL3b、HDL3c［9］，小顆粒HDL僅單向轉(zhuǎn)化為較大顆粒的HDL，此過程有利于組織細(xì)胞脂質(zhì)的輸出。不同的HDL亞組分抗動(dòng)脈硬化及促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的能力也不同［10］，HDL2b抗動(dòng)脈硬化及冠狀動(dòng)脈疾病作用最為顯著［11］。對(duì)于人類研究［12］已證實(shí)，HDL 亞組分構(gòu)成受種族，血清 TG 濃度［13］，降糖［14］或降脂藥物［15］及T2DM［16-17］、CHD［18］影響。本研究組采用來源于自然人群的配對(duì)病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)T2DM患者血清HDL2b水平明顯下降，HDL2b 與 FPG、FINS、TG、TC、HOMA-IR、10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，HDL2b與FPG及10年CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性優(yōu)于HDL。提示HDL2b具有抗動(dòng)脈硬化的作用且是HDL抗動(dòng)脈硬化作用的重要成分。大顆粒亞組分HDL2b降低可能提示發(fā)生動(dòng)脈硬化及CHD的危險(xiǎn)性增加。

T2DM具有較高的CHD的發(fā)病危險(xiǎn)，HDL的降低程度是被用來預(yù)測(cè)CHD的發(fā)病危險(xiǎn)的指標(biāo)之一，HDL2b是HDL抗動(dòng)脈硬化作用的重要亞組分，HDL2b的降低程度對(duì)預(yù)測(cè)CHD的發(fā)病危險(xiǎn)有更積極的作用。由于既往沒有快速可靠測(cè)定高密度脂蛋白亞組分的方法，HDL2b的臨床意義沒有得到體現(xiàn)。采

圖1 微流芯片及芯片圖譜Fig.1 Microfluidic chip and electrophoretic trace of microfluidic separation

The electrophoretic trace consists of the lower marker(LM)，high-density lipoprotein(HDL)region and upper marker(UM).Both markers are part of the sample dilution buffer and are used for sample alignment.A deconvolution algorithm identifies five individual peaks in the HDL region.Peak 1 represents the HDL3 component;peak 2 represents HDL3 and HDL2a;peak 3 is HDL2b;peak 4 has somehow fallen to the density range of HDL3;peak 5 is a systematic peak-a baseline of the system across all subfractions;A:serum high-density lipoprotein(HDL)subclasses analysed by microfluidic chip of a patient with type 2 diabetes mellitus(T2DM);B:serum high-density lipoprotein(HDL)subclasses analysed by microfluidic chip of a subject with normal fasting glucose(NFG).用微流芯片技術(shù)測(cè)定HDL2b、HDL2b/HDL比率可以使我們更深入的了解T2DM脂代謝紊亂的特點(diǎn)及其意義。

表3 HDL、HDL2b、HDL2b/HDL比率與其他因素的相關(guān)性Tab.3 Regression analyses of HDL 2b in relation to disease status and other risk factors

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