楊光燃 阿 叁 馮 偉 馬 靖 朱曉蓉 安艷華 路晶凱 張秀清 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730;2.深圳華大基因研究院，深圳 518083)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的合并癥之一。在大多數(shù)國(guó)家，DR尤其是增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，不僅是長(zhǎng)病程糖尿病患者最常見、最主要的致盲原因，還是當(dāng)今全世界20～65歲勞動(dòng)群體的主要致盲原因。全球每年約有300～400萬人因DR而失明，其致盲率是非糖尿病患者的10～25倍［1］。除高血糖以及環(huán)境因素外，遺傳因素在DR的發(fā)生中同樣起著重要的作用。DR是一個(gè)多基因作用的疾病，每個(gè)基因都存在多態(tài)性現(xiàn)象。

全基因組外顯子測(cè)序是在全基因組范圍內(nèi)，對(duì)所有基因編碼蛋白質(zhì)區(qū)域的每一個(gè)堿基進(jìn)行突變檢測(cè)。本研究擬利用目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)PDR患者的基因外顯子組進(jìn)行測(cè)序，研究PDR與基因多態(tài)性的關(guān)系，尋找與PDR發(fā)病相關(guān)的基因及單核苷酸多態(tài)性。本研究組以2型糖尿病患者為研究對(duì)象，考慮到DR常發(fā)生在糖尿病病史前10年，因而選擇糖尿病病史至少10年但無視網(wǎng)膜病變(nondiabetic retinopathy，NDR)的患者作為對(duì)照組;選擇PD患者作為病例組進(jìn)行病例對(duì)照研究。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

選擇于2009年1月至2010年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院就診的2型糖尿病患者中進(jìn)行彩色眼底照相及眼科醫(yī)師檢眼鏡檢查者。根據(jù)2002年制定的國(guó)際糖尿病視網(wǎng)膜病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期［2］，共入選無DR且糖尿病病史10年以上者240例，PDR患者320例。進(jìn)一步選擇年齡45～75歲，糖尿病病史10年以上，空腹血糖＞6.5 mmol/L且糖化血紅蛋白≥7.0%，尿白蛋白排泄率＜300 μg/min且血肌酐＜445 μmol/L的北方漢族無DR患者50例作為對(duì)照組，男、女各25例。選擇年齡45～75歲，糖尿病病史＜15年，11.0% ＞糖化血紅蛋白≥7.0%，血肌酐＜445 μmol/L北方漢族PDR患者50例作為病例組，男、女各25例。各入選患者之間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn):1)其他內(nèi)分泌疾患;2)酮癥酸中毒、高滲昏迷等急性病;3)自身免疫性疾病;4)青光眼、白內(nèi)障、眼外傷等影響眼底分級(jí)的疾病;5)近期內(nèi)有手術(shù)、急性感染，心腦血管疾病急性發(fā)作及其他應(yīng)激狀態(tài)者;6)惡性腫瘤;7)妊娠;8)少數(shù)民族;9)高度近視;10)1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及慢性胰腺炎;糖尿病分型不明確;11)合并非糖尿病所致的眼底疾患;12)貧血。

1.2 臨床指標(biāo)測(cè)定方法

①測(cè)量血壓、體質(zhì)量、身高、腰圍、臀圍，并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)和腰臀比。② 全部患者空腹取血:測(cè)定肝腎功能、血脂、空腹血糖、糖化血紅蛋白。糖化血紅蛋白采用高壓液相法(variantⅡHbA1c高壓液相色譜分析儀，美國(guó)伯樂公司)，正常參考范圍4.0% ～6.0%。③ 8 h尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)測(cè)定:所有患者收集晚10∶00到次日早晨6∶00共8 h的尿液，以化學(xué)發(fā)光法(Immulite 1000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，美國(guó)德普公司)測(cè)定UAER。測(cè)定時(shí)排除泌尿系感染、發(fā)熱及劇烈運(yùn)動(dòng)等情況。所有患者均測(cè)定2次，取兩次測(cè)定結(jié)果的平均值。以UAER＞20 μg/min診斷為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)。④ 眼底檢查:所有2型糖尿病患者均由眼科醫(yī)師進(jìn)行散瞳后眼底檢查。同一患者散瞳后由本科室技術(shù)人員應(yīng)用彩色眼底照相機(jī)(TRC-NW7SF，日本Topcon公司)行眼底照相檢查，拍攝雙眼眼底彩色照片。根據(jù)2002年制定的國(guó)際糖尿病視網(wǎng)膜病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期［2］。2種方法診斷結(jié)果一致的患者入選本研究。按最重的眼的DR嚴(yán)重程度分級(jí)進(jìn)行分組。

1.3 基因組DNA提取及外顯子組測(cè)序分析

取全血標(biāo)本1 mL應(yīng)用外周血DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度及純度的測(cè)定。合格的DNA樣本送深圳華大基因研究院，應(yīng)用NimbleGen商業(yè)化2.1M外顯子序列捕獲芯片進(jìn)行外顯子組區(qū)域的測(cè)序。整個(gè)樣品制備過程包括雜交文庫制備、芯片雜交洗脫以及雜交后測(cè)序文庫制備，通過Illumina測(cè)序系統(tǒng)(Illumina HiSeq 2000測(cè)序系統(tǒng)，美國(guó)Illumina公司)獲得外顯子序列信息。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;尿素氮、肌酐和UAER為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。2組間比較，正態(tài)分布的連續(xù)變量采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05(雙側(cè)法)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

50例 NDR組中男性25例，女性25例，年齡(60.00±7.89)歲;50例PDR病例組中男性25例，女性25例，年齡(55.81±7.75)歲。2組患者的糖尿病病程分別為(13.67 ±3.87)年、(10.55 ±4.16)年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001，表1)。NDR組與PDR組BMI、腰臀比、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、尿素氮、肌酐濃度2組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。PDR組UAER濃度較NDR組高(分別為6.77 μg/min、64.15 μg/min，P=0.000，表1)。

表1 NDR和PDR組患者臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of patients between NDR and PDR group

PDR組較NDR組有較高的糖尿病腎病患病率，分別為 70.6%、21.6%(P=0.000)。NDR 和 PDR 組2組高血壓、冠心病、腦梗死的患病率分別為57.7%、60.4%;12.8%、13.0%;11.6%、6.4%，2 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。NDR組和PDR組間有糖尿病家族史者比例差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為45.7%、43.8%(P＞0.05)。

2.2 外顯子組測(cè)序結(jié)果

外顯子組測(cè)序分析對(duì)目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度為42×。測(cè)序原始序列平均長(zhǎng)度為89 bp。最小等位基因頻率大于1%的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)為583 198個(gè);進(jìn)一步篩選測(cè)序深度大于4×且錯(cuò)誤率小于0.1%的 SNPs共計(jì)165 560個(gè)，其中已報(bào)道非同義SNPs 14 386個(gè)，新的非同義SNPs 6 444個(gè)(表2)。

3 討論

在基因組水平，兩個(gè)人類個(gè)體之間僅有約0.1%的差異。這些差異可用于解釋個(gè)體在疾病易感性方面的不同。外顯子組只占人類基因組總量1%，包含了合成蛋白質(zhì)所需要的信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的大部分功能性變異，同時(shí)外顯子區(qū)域是目前基因組中被研究得最為成熟的一部分，使得研究人員能夠?qū)Πl(fā)現(xiàn)的變異所在的基因進(jìn)行注釋和功能途徑分析。與全基因組重測(cè)序相比，外顯子組測(cè)序在保證有效獲取絕大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的基因信息的同時(shí)大大降低了測(cè)序的總數(shù)據(jù)量，從而顯著降低了測(cè)序費(fèi)用，因而成為目前的研究熱點(diǎn)。目前尚無關(guān)于PDR患者外顯子組測(cè)序研究。

表2 100例糖尿病患者外顯子組測(cè)序單核苷酸多態(tài)性結(jié)果Tab.2 Numbers of single nucleotide polymorphisms by exome sequencing in 100 diabetic patients

本課題組應(yīng)用目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)PDR患者進(jìn)行DNA外顯子組測(cè)序，選擇糖尿病病史10年以上且糖化血紅蛋白大于7.0%的NDR患者作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)多個(gè)可能與PDR易感性相關(guān)的SNPs。這些SNPs的改變尤其是非同義突變，可能通過引起編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)改變，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能、活性發(fā)生改變，從而參與PDR的發(fā)生和發(fā)展。以往關(guān)于DR基因多態(tài)性研究主要是有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性［3］、可變數(shù)的串連重復(fù)序列［4］、單核苷酸多態(tài)性等［5-6］。基因分型芯片僅對(duì)常見多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，而與重測(cè)序研究相比，在基于芯片的基因分型研究中低頻突變的因素往往被忽略了;無法研究低頻率多態(tài)性位點(diǎn)將漏掉大量疾病關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，造成“遺傳度缺失”。

已有報(bào)道［7］應(yīng)用外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)50個(gè)藏族人的外顯子進(jìn)行測(cè)序研究并尋找到與藏族人高原適應(yīng)性密切相關(guān)的候選基因。對(duì)200個(gè)丹麥人的外顯子測(cè)序研究［8］揭示大量低頻率非同義突變的存在，顯示編碼區(qū)包含的低頻有害突變比例比預(yù)期大很多，該研究首次證實(shí)，影響人類健康和疾病易感性的多態(tài)性位點(diǎn)在人群中往往頻率低，但是相關(guān)位點(diǎn)的個(gè)數(shù)很多。本課題組的研究顯示存在大量的可能與PDR易感性有關(guān)的 SNPs，有一些是已報(bào)道的［9-10］，尚有一些SNPs是新發(fā)現(xiàn)的，關(guān)于這些SNPs與PDR的關(guān)系及在PDR發(fā)生中的作用有待于進(jìn)一步研究明確。

總之，對(duì)50對(duì)北方漢族NDR和PDR的2型糖尿病患者的外顯子組測(cè)序分析研究顯示，存在大量可能與PDR易感性相關(guān)的SNPs，新一代的外顯子組重測(cè)序研究將更有助于研究基因易感性與2型糖尿病患者PDR的關(guān)系。但還需進(jìn)一步在大樣本的實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)這些SNPs與PDR發(fā)生的關(guān)系，并明確其在PDR發(fā)生和發(fā)展中的具體作用機(jī)制。

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