高華 史偉云 張靜靜 王曄 謝立信

角膜移植已有百余年的歷史，以往多數(shù)觀點認為角膜移植術(shù)后主要是免疫因素(如急性排斥反應)影響角膜移植片的透明［1］，但是近10年的研究發(fā)現(xiàn)，除了免疫因素外，非免疫因素也參與了該過程。臨床上有很多角膜移植受者并未觀察到明顯的免疫排斥反應，但其移植片的透明度逐漸下降，最終發(fā)生角膜移植片慢性失功(chronic corneal allograft dysfunction，CCAD)［2］。即使是自體角膜移植，其術(shù)后不發(fā)生免疫排斥反應，角膜移植片內(nèi)皮細胞密度同樣呈超生理性下降［3］。所以推測角膜移植手術(shù)后免疫和非免疫因素都參與了CCAD的發(fā)生和發(fā)展。本研究主要通過檢測小鼠CCAD模型角膜移植片中CD4+T淋巴細胞、F4/80、TGF-β、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、α 平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)表達，探討免疫和非免疫因素在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 建立小鼠CCAD模型

1.1.1 實驗動物

BALB/c小鼠(H-2d)和C57BL/6小鼠(H-2b)，雌雄各半，8周齡，購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。將雌性BALB/c小鼠與雄性C57BL/6小鼠雜交，獲得CB6F1代(簡稱F1代)小鼠，見圖1。

圖1 雄性C57BL/6小鼠(中)與雌性BALB/c小鼠(右)雜交，獲得抗原半相合CB6F1代(左)小鼠

1.1.2 實驗分組和手術(shù)方法

實驗共分為4組，每組18只小鼠。異系移植組供體為C57BL/6小鼠，F(xiàn)1代移植組供體為F1代小鼠，同系移植組供體為BALB/c小鼠，3組受體均為BALB/c小鼠;對照組為正常BALB/c小鼠。根據(jù)之前的研究，F(xiàn)1代移植組和同系移植組是與角膜移植后臨床接近的小鼠CCAD模型［2］，異系移植組和對照組主要用于對照研究。

手術(shù)前1 d用1%阿托品眼膏涂眼1次，鹽酸氯胺酮注射液(34 mg)和鹽酸氯丙嗪注射液(0.4～0.6 mg)混合液腹腔內(nèi)注射麻醉，行穿透角膜移植(penetrating keratoplasty，PK)，移植片與植床直徑分別為2.5 mm 和2.0 mm，11-0 尼龍線(Mani縫線)間斷縫合8針，無菌空氣形成前房。涂0.3%妥布霉素眼膏，10-0縫線間斷1～2針縫合眼瞼。

1.2 術(shù)后觀察和檢測指標

1.2.1 角膜移植片觀察

PK術(shù)后3 d拆除眼瞼縫線，用裂隙燈顯微鏡觀察角膜移植片透明情況。所有小鼠每周觀察2次，觀察時間大于100 d，主要記錄免疫排斥反應發(fā)生和角膜移植片透明情況。角膜移植片評分指標如下:0分代表移植片透明;1分代表微小的表淺非間質(zhì)混濁，透過角膜可見瞳孔緣和虹膜血管;2分代表微小深在的間質(zhì)性混濁，瞳孔緣和虹膜血管可見;3分代表中等程度的間質(zhì)混濁，僅瞳孔緣可見;4分代表大片的間質(zhì)混濁，僅部分瞳孔緣可見;5分代表非常大的間質(zhì)混濁，前房不可見。如小鼠PK術(shù)后移植片評分 ＞2分，判定為移植失?。?-5］。

1.2.2 免疫組織化學檢查

分別在PK術(shù)后3周、2個月、3個月隨機從各組抽取2只小鼠。頸椎脫臼法處死小鼠后取右側(cè)眼球，置于冷凍膠中－80℃包埋，冷凍切片機做6 μm厚連續(xù)切片，室溫干燥60 min，免疫組織化學法檢測CD4+T淋巴細胞、F4/80(英國Serotec公司)、TGF-β(美國Santa Cruz公司)、bFGF和 α-SMA(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組織化學用二抗采用熒光標記(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品)。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR檢查

PK術(shù)后3周、2個月和3個月，分別從4組各隨機選取1只小鼠。頸椎脫臼法處死小鼠，角鞏膜剪沿角膜緣剪下角膜組織，之后將角膜組織剪成4部分提取總RNA，取約1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)禽類成髓細胞病毒轉(zhuǎn)錄酶使用手冊配置10 μL反應體系，反應條件為45℃ 30 min、99℃5 min、5℃ 5 min。取反轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物，首先以巢式外層引物進行PCR，100 μL反應體系，共35個循環(huán)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶?？俁NA分離試劑盒購自德國MN公司，引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自Bio Basic Inc公司。引物F4/80和TGF-β序列分別如下:5-GGTATTGCTGCCTTGCCGTT-3和 5-TCCTCTGACACGTGAGCATC-3;5-TCCTGTAGACGTGTTCCAGA-3和5-TGCTTAGACGTGCAGGTCAA-3。結(jié)果采用Image J圖像分析軟件處理并作量化分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行處理。正態(tài)分布的計量資料采用One-Way ANOVA檢驗，非正態(tài)分布的計量資料和計數(shù)資料組內(nèi)比較采用Kruskal-Wallis檢驗，組間比較采用Mann-Whitney檢驗，P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CCAD發(fā)生情況

異系移植組在術(shù)后4周內(nèi)發(fā)生角膜移植片混濁，同時伴有大量新生血管怒張長入移植片;在術(shù)后2周，角膜移植片混濁程度平均分超過2分，至術(shù)后4周評分接近4分，之后稍有下降，維持在3分左右。F1代移植組38.9%(7/18)小鼠在術(shù)后2～3個月內(nèi)逐漸發(fā)生角膜移植片混濁，無明顯新生血管長入角膜移植片;術(shù)后1周時角膜移植片評分超過1分，之后下降并在較低水平維持4周后緩慢上升，至術(shù)后100 d，角膜移植片平均評分2分。同系移植組角膜移植片功能雖然有下降，22.2%(4/18)的小鼠上皮下輕度混濁，但始終未發(fā)生2級及以上角膜移植片混濁;術(shù)后1周時角膜移植片評分1分，之后下降并始終維持在較低水平，始終未超過1分。對照組角膜始終透明，移植片評分始終為零。4組角膜移植片評分情況詳見圖2，各時間點組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.001)。

圖2 各組移植后角膜移植片評分變化

2.2 各組角膜移植片組織CD4+T淋巴細胞浸潤情況

術(shù)后3周，異系移植組角膜移植片基質(zhì)見大量CD4+T淋巴細胞浸潤(圖3A1)，而此時F1代和同系移植組偶見 CD4+T淋巴細胞浸潤(圖3B1，3C1)，對照組未見CD4+T淋巴細胞浸潤(圖3D1)。術(shù)后2個月，異系移植組角膜移植片基質(zhì)內(nèi)仍然可見較多CD4+T淋巴細胞浸潤(圖3A2)，較3周時減少;F1代移植組、同系移植組及對照組未見CD4+T淋巴細胞浸潤(圖3B2、C2、D2)。術(shù)后3個月，除異系移植組角膜移植片基質(zhì)內(nèi)偶見CD4+T淋巴細胞外(圖3A3)，其余各組均未見CD4+T淋巴細胞浸潤(圖3B3、C3、D3)。

2.3 各組角膜移植片組織F4/80表達情況

異系移植組移植后3周、2個月及3個月移植片基質(zhì)層F4/80表達均為陽性，陽性細胞呈細索樣、梭形或多型性分布(見圖4A)。F1代移植組和同系移植組各時間點角膜移植片基質(zhì)層F4/80均有表達，表達強度較異系移植組弱(見圖4B、C)。對照組角膜緣基質(zhì)層可見到F4/80表達，角膜中央深基質(zhì)層偶見F4/80表達(見圖4D)。

移植片組織反轉(zhuǎn)錄PCR檢測顯示，各移植組均表達F4/80:異系移植組術(shù)后3周表達較弱，2個月和3個月時表達增強;F1代移植組3周和2個月時表達較弱，術(shù)后3個月時表達較強;同系移植組術(shù)后各時間點表達均較弱;對照組各時間點未見F4/80表達。量化分析結(jié)果見圖5。

圖3 各組移植后3周、2個月、3個月角膜移植片基質(zhì)CD4+T淋巴細胞表達情況(熒光染色 ×200)

2.4 各組角膜移植片組織TGF-β表達情況

TGF-β陽性表達組織呈現(xiàn)細索樣亮熒光。各組角膜上皮層均可以見到TGF-β表達。移植后各組不同時間點均有TGF-β表達，術(shù)后3周、2個月表達較強(見圖6A、B、C)，術(shù)后3個月表達減弱。對照組角膜基質(zhì)及內(nèi)皮層未見TGF-β表達(見圖6D)。

圖4 各組移植后2個月角膜移植片F(xiàn)4/80表達情況(熒光染色 ×200)

反轉(zhuǎn)錄PCR定量檢測顯示，各組不同時間點TGF-β均有表達，異系移植組和F1代移植組術(shù)后3周或2個月表達量較高，術(shù)后3個月表達量明顯下降;同系移植組術(shù)后3周TGF-β表達量較高，術(shù)后2個月和3個月時TGF-β表達量下降。對照組各時間點TGF-β均呈低表達。量化分析結(jié)果見圖7。

圖5 各組移植后3周、2個月、3個月角膜移植片F(xiàn)4/80表達結(jié)果:移植各組早期表達均較弱，之后有增強;對照組始終不表達

圖6 各組移植后2個月角膜移植片TGF-β表達情況(熒光染色 ×200)

2.5 各組角膜移植片組織bFGF表達情況

bFGF陽性表達呈現(xiàn)細索樣亮熒光。異系移植組角膜基質(zhì)內(nèi)可見bFGF表達(見圖8A)，F(xiàn)1代移植組和同系移植組偶見表達(見圖8B、8C)，對照組未見表達(見圖8D)。

2.6 各組角膜移植片組織α-SMA陽性表達情況

異系移植組術(shù)后3周移植片未見α-SMA表達，術(shù)后2個月和3個月時出現(xiàn)α-SMA表達，陽性表達呈細索樣亮熒光(見圖9A);F1代移植組術(shù)后3周、2個月時無明顯表達，3個月時角膜基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)表達(見圖9B);同系移植組術(shù)后3周、2個月時無明顯表達，3個月角膜基質(zhì)少量表達(見圖9C);對照組小鼠角膜各層細胞α-SMA未見表達(見圖9D)。

圖7 各組移植后3周、2個月、3個月角膜移植片TGF-β表達結(jié)果:各組早期表達較強，之后有減弱，對照組始終在較低水平

圖8 各組移植后2個月角膜移植片bFGF表達情況(熒光染色 ×200)

圖9 各組移植后3個月角膜移植片α-SMA表達情況(熒光染色 ×200)

3 討論

同種異體角膜供體組織移植給受者后，受者的免疫系統(tǒng)可以對異體抗原進行識別，或者因為手術(shù)損傷和周圍微環(huán)境改變都可能使移植物處于應激狀態(tài)，導致移植物功能緩慢受損和下降［1-3］。所以，推測角膜移植術(shù)后免疫和非免疫因素都可能參與了移植物慢性失功的發(fā)生和發(fā)展。

免疫反應是指機體受到抗原刺激后，體內(nèi)抗原特異性淋巴細胞在抗原呈遞細胞的作用下識別抗原分子、活化、增殖、分化，并表現(xiàn)出一定生物學效應的過程。宮華青［6］和 Bell［7］等對發(fā)生慢性失功角膜移移植片的超微結(jié)構(gòu)觀察并沒有發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應的證據(jù)。先前的研究之所以不能證明免疫因素是否參與了CCAD的過程，主要原因是不能獲得臨床慢性失功過程中的角膜標本，而利用建立的小鼠CCAD模型可以很方便地對該過程進行動態(tài)觀察［5］。本實驗結(jié)果顯示，異系移植組在術(shù)后2～3周移植片發(fā)生混濁時，移植片中有大量CD4+T淋巴細胞浸潤。說明此時移植片發(fā)生急性排斥反應。F1代移植組和同系移植組術(shù)后3周時角膜移植片透明，移植片中偶見或見不到T淋巴細胞浸潤。F4/80是抗原呈遞細胞(成熟的單核/巨噬細胞)的表面標志。本研究CCAD模型的角膜移植片組織見到較多抗原呈遞細胞，提示供受者之間的主要組織相容性較異系移植組供受體接近，抗原量尚不足以引起大量的致敏淋巴細胞浸潤和臨床可見的急性排斥反應。但少量淋巴細胞和抗原呈遞細胞浸潤仍可能會造成臨床上難以發(fā)現(xiàn)的慢性排斥反應，而這種慢性損害會對移植片產(chǎn)生影響，并導致其功能緩慢逐漸下降。

此外各組小鼠角膜移植片中的抗原呈遞細胞隨著移植免疫原性減弱表達減少，也說明免疫因素參與了CCAD的發(fā)生和發(fā)展。由于F1代移植組和同系移植組供體的組織相容性與受體接近，所以抗原呈遞細胞募集的致敏淋巴細胞不足以引起臨床可見的急性排斥反應，但可能會通過抗原呈遞細胞及浸潤等免疫細胞異常分泌細胞因子來改變角膜移植片所處的微環(huán)境，從而導致移植片功能緩慢下降。

全身實體器官移植術(shù)后的研究表明非免疫因素也參與了移植物慢性失功的發(fā)生和發(fā)展［8］。本研究也提示非免疫因素相關(guān)的細胞因子如TGF-β、bFGF等，可能在CCAD過程中發(fā)揮重要的作用。TGF-β和bFGF都是很強的致纖維化因子［9］，可誘導細胞凋亡和細胞外基質(zhì)積聚，α-SMA是成纖維細胞的表面標志。TGF-β和bFGF的表達與隨后的α-SMA表達提示纖維增殖在CCAD過程中可能發(fā)揮了重要的作用，角膜基質(zhì)細胞或內(nèi)皮細胞在異常細胞因子狀態(tài)下激活可能與角膜內(nèi)纖維異常形成相關(guān)。

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，臨床慢性失功角膜移植片的內(nèi)皮細胞層和后彈力層之間有異常增生的纖維樣結(jié)構(gòu)［6］。當角膜內(nèi)皮細胞處于疾病或不穩(wěn)定狀態(tài)時，分泌的后彈力層會出現(xiàn)纖維增殖樣改變［10］。本研究觀察到的后彈力層與內(nèi)皮細胞層之間的板層纖維樣改變提示角膜移植后內(nèi)皮細胞可能長期處于不穩(wěn)定或病理狀態(tài)，最終導致內(nèi)皮細胞萎縮退化而逐漸喪失功能。這種不穩(wěn)定狀態(tài)可能與TGF-β、bFGF等細胞因子在移植后異常表達有關(guān)。移植片基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞在異常表達細胞因子的作用下，表型向成纖維細胞轉(zhuǎn)化，或者在異常細胞因子的作用下分泌異常的后彈力層。如此反復，最終導致內(nèi)皮細胞功能超生理性下降和角膜內(nèi)纖維細胞異常增殖，表現(xiàn)為移植物功能緩慢下降。

角膜移植術(shù)后免疫和非免疫相關(guān)因素在CCAD發(fā)展過程中的作用并不能完全分開，二者之間有聯(lián)系。如抗原呈遞細胞可以在存在異常抗原的情況下聚集，而非特異性的炎癥也能誘發(fā)其表達增多［11］。非特異性的細胞因子TGF-β、bFGF等可以在發(fā)生抗原呈遞細胞聚集時表達異常增多，而手術(shù)的刺激和炎癥細胞浸潤以及微環(huán)境改變等都可能使其表達異常。因此，免疫因素和非免疫因素在CCAD發(fā)生發(fā)展的過程中可能存在交互作用，最終導致CCAD。

通過本研究可以得出以下初步結(jié)論:免疫因素和非免疫因素均參與了CCAD的發(fā)生和發(fā)展。移植術(shù)后抗原依賴性免疫細胞浸潤，非抗原依賴性炎癥細胞浸潤及各種細胞因子異常表達在CCAD的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要的作用。

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