黃明艷 羅勝勇

（1 淮南師范學院醫(yī)務室，安徽 淮南 232001；2 安徽省醫(yī)學科學研究院藥理毒理研究所，安徽 合肥 230061）

肝纖維化（hepatic fibrosis）是各種慢性肝病發(fā)展至肝纖維化的必由之路，部分甚至發(fā)展為肝癌，因此，延緩、阻斷肝纖維化的病變過程，對控制肝硬化的發(fā)生發(fā)展有重要意義[1,2]。山茶花總黃酮（total of flacone C，TFC）是從山茶花種提取的有效部位，以往研究及預實驗表明其具有一定的抗炎、抗氧化及抑制細胞凋亡等作用[3]。本實驗在腹腔注射豬血清誘導大鼠肝纖維化模型上觀察其對肝纖維化的抑制作用，并初步探討其作用機制。

表1 TFC對肝纖維化大鼠肝功能的影響（±s，n=10）

表1 TFC對肝纖維化大鼠肝功能的影響（±s，n=10）

與正常組比較：△△P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

Group Dose（mg/kg） AST（U/L） ALT（U/L） TP（g/L） ALB（g/L）Nomal - 185.42±6.82 108.00±28.19 68.82±2.40 27.74±0.92 Model NS 470.6±61.86△△ 508.0±85.76△△ 49.65±2.85△△ 21.82±1.02△△Col 0.3 377.1±51.03** 329.56±80.31** 54.84±6.12* 23.80±4.00*TFC 100 288.22±45.27** 274.6±22.18** 56.37±8.40* 23.48±2.90*50 296.4±52.30** 286.67±68.71** 55.38±6.75* 23.36±2.25*25 434.00±62.12 423.67±104.80 48.70±9.52 21.65±4.43

表2 TFC對肝纖維化大鼠透明質酸、TGF-β1及羥脯氨酸的影響（±s，n=10）

表2 TFC對肝纖維化大鼠透明質酸、TGF-β1及羥脯氨酸的影響（±s，n=10）

與正常組比較：△△P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

Group Dose（mg/kg） HA（ng/mL） HYP（μg/g） TGF-β1（ng/mL）Nomal - 165.35±21.61 0.28±0.09 2.16±0.63 Model NS 280.37±32.60△△ 0.58±0.22△△ 5.51±1.80△△Col 0.3 238.34±34.62** 0.45±0.11* 3.88±1.05*TFC 100 230.52±34.80** 0.43±0.10* 3.78±1.28*50 225.45±28.60** 0.41±0.13* 3.82±1.08*25 258.70±32.65 0.52±0.15 4.21±1.25

1 材料與方法

1.1 材料

①實驗動物：SD雄性大鼠180～210g，由南通大學實驗動物中心提供，動物合格證：SCXK（蘇）2008-0010。②藥品與試劑：TFC由安徽醫(yī)科大學天然藥物研究所提供，黃色粉末，純度75%，用前用生理鹽水溶解至所需濃度；豬血清，取新鮮豬血離心過濾除菌自制；秋水仙堿（Col），昆明制藥集團股份有限公司生產，批號：090325-01；天津化學試劑研究所提供；羥脯氨酸試劑盒，批號：20081224，南京建成生物工程研究所提供;血清HA試劑盒，北京華英生物技術研究所提供，批號：20091020；TGF-β1試劑盒，promega公司提供，Lot no.261111，ELISA法檢測。③實驗儀器：7080全自動生化分析儀，日立公司生產；550酶標儀，BIO-RAD生產；UV-240紫外分光光度計，日本島津公司生產。

1.2 方法

①分組及給藥：取雄性大鼠60只，隨機分成6組，每組10只，分別為正常組，模型組，TFC高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg），陽性對照組（秋水仙堿0.3mg/kg）。除正常組外，其余各組均進行肝纖維化模型制備：各大鼠腹腔注射豬血清0.5mL，每周2次，連續(xù)12周。在制備模型的同時，各給藥組分別給相應的藥物，每天1次，共12周，正常組和模型組給等量的生理鹽水灌胃。第12周末處死動物。②檢測指標：丙氨酸轉氨酶（AST），天冬氨酸轉氨酶（ALT），總蛋白（TP），白蛋白（ALB）： 血生化分析儀檢測；血清HA/ TGF-β1：分離血清，按試劑盒說明，采用ELISA（酶聯免疫吸附）法檢測，550酶標儀比色并判讀結果；羥脯氨酸：取左肝葉組織，制成勻漿按試劑盒說明檢測。

病理檢查：取左肝葉組織，10%甲醛固定，HE普通和VG特殊染色，觀察肝臟組織纖維化病變，并進行病理評分。肝組織纖維化程度分期標準[4]，①S0：無纖維化病變。②S1匯管區(qū)纖維化擴大，局限竇周及小葉內纖維化，不影響小葉結構的完整性。③S2匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構仍保留。④S3大量纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化。⑤S4早期肝硬化，肝實質廣泛破壞，彌漫性纖維增生及假小葉形成。

1.3 數據處理

2 結 果

2.1 TFC對肝纖維化大鼠肝功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清丙氨酸轉氨酶（AST），天冬氨酸轉氨酶（ALT），水平較正常組明顯升高，總蛋白，白蛋白含量明顯降低，表明造模后，肝臟功能明顯下降；與模型組比較，TFC高、中劑量組ALT，AST水平均明顯降低，TFC高、中劑量組TP和ALB明顯增高。結果見表1。

2.2 TFC對肝纖維化大鼠透明質酸、羥脯氨酸、TGF-β1的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清透明質酸、TGF-β1和肝組織羥脯氨酸含量明顯升高，與模型組比較，TFC高、中劑量組大鼠血清透明質酸、TGF-β1含量明顯降低，肝組織中羥脯氨酸含量明顯降低。結果見表2。

2.3 TFC對肝纖維化大鼠肝臟病理學改變的影響

肝組織HE和V.G染色顯示，正常組大鼠肝小葉結構正常，肝索排列規(guī)則，肝竇與匯管區(qū)成纖維細胞少，無肝細胞變性、壞死；模型組大鼠小葉結構紊亂，部分肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，部分肝細胞壞死，纖維組織增生明顯；TFC高、中劑量組能明顯改變肝小葉結構，減輕肝細胞壞死，減少纖維組織增生。結果見表3及圖1。

表3 TFC對肝纖維化大鼠肝臟病理學改變的影響（±s，n=10）

表3 TFC對肝纖維化大鼠肝臟病理學改變的影響（±s，n=10）

與正常組比較：△△P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05

肝組織纖維化病理分期S0 S1 S2 S3 S4 Nomal - 10 0 0 0 0 Model NS 0 1 2 4 3△△Col 0.3 1 5 4 0 0*TFC 100 2 5 3 0 0*50 2 5 3 0 0*25 1 2 4 2 0 Group Dose（mg/kg）

3 討 論

建立合適的肝纖維化動物模型，是研究肝纖維化發(fā)生機制、篩選護肝藥物的前提。本研究選用豬血清誘導大鼠免疫性肝纖維化，與乙型肝炎病毒引起的慢性活動性肝炎和肝硬化免疫調節(jié)功能紊亂有相似性，對指導臨床研究有很重要的價值[5]。血清中AST、ALT是用來診斷肝實質性損壞的主要酶類，其活性的高低變化與肝細胞受損的程度相一致；肝臟也是合成蛋白質的場所，肝功能異常時，白蛋白含量降低，總蛋白含量不變、降低或升高，因此，蛋白質的含量在一定程度上也反應了肝功能的變化情況，本研究現實，與模型組比較，TFC高、中劑量組可明顯降低肝纖維化大鼠血清AST、ALT的活力的升高，并增加血清中ALB和TP的含量，說明TFC具有一定的保護肝細胞，減輕肝損傷作用。

圖1 TFC對肝纖維化大鼠肝臟病理學改變的影響（V.G染色×200）

HA是由體內間質細胞合成的一種葡萄多糖，是構成肝細胞外基質的重要成分之一，由肝內間質細胞合成，內皮細胞參與降解，血清中含量升高可間接推測肝功能及肝纖維化程度[6-9]。肝纖維化的細胞外基質成分主要為膠原纖維，脯氨酸羥化為HYP是膠原合成的必須步驟，HYP是膠原蛋白所特有的氨基酸，測定肝組織中HYP含量可明確膠原總體水平，是反映肝臟纖維化程度的直接指標[10,11]。本研究顯示TFC高、中劑量組可明顯降低血清中HA含量及肝組織中HYP含量，提示其對大鼠肝纖維化有一定的抑制作用，同時病理檢查結果也與其相一致。

肝星狀細胞（HSCs）是生成細胞外基質（ECM）的主要細胞[12]，它的激活是肝纖維化發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)，在此過程中，因肝組織內的炎性反應而產生的一系列細胞因子對于HSCs的活化和纖維膠原的大量產生起主要促進作用，其中TGF-β1就是一種已明確的促進HSCs活化的重要刺激因子，并且有研究表明，在目前所明確的所有肽類生長因子中，TGF-β1是促進ECM合成作用最強的細胞因子[13-16]，因此，抑制肝組織中TGF-β1的表達對于逆轉肝纖維化具有重要意義[17,18]。本研究顯示TFC高、中劑量組大鼠血清中TGF-β1的水平明顯降低，提示TFC可能通過抑制TGF-β1的產生，抑制HSC的活化，減少ECM的合成，從而達到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，TFC對豬血清誘導大鼠肝纖維化有明顯的抑制作用，其機制可能與抑制TGF-β1的產生有關。

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