謝延平 劉利 劉振武 顏繼英 楊朝暉 劉炳智 江麗強

近年來隨著分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展，基因工程作為一種治療手段越來越被廣泛應(yīng)用于外科領(lǐng)域。該項目的研究，就是運用當(dāng)今的分子生物學(xué)技術(shù)，采用重組質(zhì)粒載體基因轉(zhuǎn)染模型動物腰椎間盤髓核細(xì)胞，定量的觀察基因的有效表達(dá)，從而為椎間盤退變的基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 重組質(zhì)粒DNA(15 μl TGF-β1 cDNA，克隆在 EcoRⅠ位點，購于上海第二軍醫(yī)大學(xué)微生物實驗室)，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，大腸桿菌JM109菌液(購于上海生工生物技術(shù)有限公司)，EcoRⅠ內(nèi)切酶、蛋白Marker(購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(購于美國sigma生物技術(shù)有限公司)，TGF-β1兔抗兔一抗(購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，IgG鼠抗兔二抗(購于北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.2 構(gòu)建椎間盤退行性變的動物模型 選擇健康成年的新西蘭大白兔21只，雌雄不拘，用20%的烏拉坦4 ml/kg靜脈注射麻醉實驗動物后，采用腰椎側(cè)前方倒八字手術(shù)入路，于腹膜外顯露腰椎間盤，用髓穿針于 L3～4，L4～5，L5～6間隙各注入 20 μl 0.9%氯化鈉溶液，并于L3～4所對應(yīng)的腰大肌處以黑色絲線做標(biāo)記，術(shù)后8周隨機(jī)處死1只實驗動物，檢測退變程度。

1.3 重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增與提取 采用劃痕法在平板培養(yǎng)基上接種大腸桿菌JM109菌液，37℃過夜培養(yǎng)，挑選單菌落于液體培養(yǎng)基中37℃劇烈搖震培養(yǎng)至OD260=0.3～0.4。采用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)，然后加入含有目的基因的質(zhì)粒DNA，通過42℃熱休克轉(zhuǎn)化至大腸桿菌體內(nèi)，繼續(xù)于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液平鋪于含有抗生素和X-gal、IPTG的平板培養(yǎng)基中，通過抗藥性篩選及藍(lán)白斑試驗挑選所需的大腸桿菌菌株，繼續(xù)于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。采用離心柱式快速回收提取質(zhì)粒DNA的方法，提取并純化小量的重組質(zhì)粒DNA，用分光光度法測定其濃度及純度，最后用限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 活體轉(zhuǎn)染 對已形成椎間盤退行性變的動物模型，再次施行對側(cè)腹部入路手術(shù)，用髓穿針于L5～6間隙注射20 μl含有治療基因 TGF-β1 的重組質(zhì)粒 DNA，L3～4間隙注射20 μl蛋白因子TGF-β1，術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由活動。

1.5 動物分組及標(biāo)本處理 所有實驗動物于2次手術(shù)后分成1 d、4 d、1周、2周4個時間組，每個時間組5只實驗動物，其中各個時間組內(nèi)又按腰椎間隙的不同又分為實驗組(L5～6)、實驗對照組(L3～4)和空白組(L4～5)。各時間組分別于手術(shù)后不同時期處死動物，取出相應(yīng)椎間盤后置4%多聚甲醛保存，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，應(yīng)用TGF-β1免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型的鑒定 (1)肉眼觀察:造模術(shù)后8周，隨機(jī)處死 1 只模型動物解剖觀察，L3～4、L4～5、L5～6椎間盤周緣與毗鄰組織粘連緊密，不易分離，椎間盤成骨樣硬化，間盤突向硬脊膜，脊神經(jīng)根有粘連，分離困難。(2)鏡下觀察:8周后，椎間盤縮小，骨質(zhì)增生明顯，大部分區(qū)域為類骨質(zhì)和骨質(zhì)，纖維組織被擠向邊緣，髓核消失。(3)腰椎X線片顯示:8周后腰椎間隙明顯變窄，甚至消失，可見到椎間隙內(nèi)有線形鈣化。見圖1～4。

圖1 鏡下觀察正常髓核組織(HE×200)

圖2 造模術(shù)后2周鏡下觀察退變的髓核組織(HE×200)

圖3 基因轉(zhuǎn)染后2周注射轉(zhuǎn)基因的椎間盤髓核組織(免疫組化×200)

圖4 瓊脂糖凝膠電泳后基因片段的表達(dá)

2.2 重組質(zhì)粒DNA的鑒定 (1)濃度與純度的鑒定:算得所提重組質(zhì)粒 DNA 溶液的濃度為 0.067 μg/μl，純度為 1.782。(2)重組質(zhì)粒DNA的鑒定:進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示:經(jīng)過酶切的重組質(zhì)粒DNA樣品中，可見一條插入的外源基因DNA區(qū)帶。根據(jù)對比參照物蛋白Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)，可初步判斷其為目的基因TGF-β1的插入片斷。

2.3 基因表達(dá)活性的鑒定 術(shù)后實驗組4 d即呈現(xiàn)陽性顆粒，陽性表達(dá)可持續(xù)至少2周，實驗對照組陽性表達(dá)僅維持3 d，空白組均呈陰性反應(yīng)。如圖 TGF-β1抗體被染成棕色，利用CMIAS圖像分析系統(tǒng)對各個時間組內(nèi)不同間隙的椎間盤的陽性蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量測定，其光密度值如附表所示。實驗組與實驗對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05);4 d、1周、2周時實驗組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05);1 d時實驗對照組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1，圖 5。

表1 3組在不同時期基因表達(dá)的光密度評分比較

表1 3組在不同時期基因表達(dá)的光密度評分比較

注:與空白組比較，*P＜0.05;與實驗對照組比較，#P＜0.05

時間 空白組 實驗對照組 實驗組1 d 0.242±0.0228 0.330±0.0316*0.270±0.01224 d 0.246±0.0152 0.262±0.0130 0.312±0.0179*#1 周 0.250±0.0158 0.254±0.0114 0.422±0.0482*#2 周 0.242±0.0228 0.256±0.0114 0.312±0.0179*#

圖5 3組在不同時期基因表達(dá)的光密度評分

3 討論

3.1 模型動物的構(gòu)建 (1)實驗動物的選擇:家兔為非直立嚙齒類動物，其髓核與纖維細(xì)胞形態(tài)改變同人類變化相似，但其退變程度，不如人類明顯。雖然兩者存在物種上的差別，但可作為研究椎間盤退變的實驗?zāi)Ｐ?。根?jù)本實驗觀察，造模后實驗兔的腰椎間盤病理性退變與人類相似，基本符合椎間盤退變的模型要求。(2)造模方法的選擇:綜合考慮要椎間盤退變的生理、病理機(jī)制，以及條件和地方的可行性，對實驗動物進(jìn)行無創(chuàng)性經(jīng)棘旁穿刺造模方法設(shè)計本實驗方法。實驗較順利，經(jīng)X線片，組織切片觀察，說明椎間盤退變符合實驗造模要求。(3)實驗造模機(jī)制:促使椎間盤退變的原因眾多，至今尚未清楚。實驗結(jié)果，正是椎間盤局部人為壓力，可以加劇椎間盤退變，并且光鏡下觀察其形態(tài)退變過程可以證實其造模的機(jī)制，因此，實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建可作為研究人體腰椎間盤退行性變的基礎(chǔ)，可用于病因、病機(jī)，治療學(xué)的探討。

3.2 基因轉(zhuǎn)移方式及重組載體DNA的選擇 (1)基因轉(zhuǎn)移方式:當(dāng)前實施基因轉(zhuǎn)移的途徑有兩類［1］，一類是 in vivo(在體)即活體直接轉(zhuǎn)移;另一類是 ex vivo(體外)方法。后者比較經(jīng)典、安全，而且效果較易控制，但是步驟多，技術(shù)復(fù)雜，難度大不容易推廣。相反前者方法操作簡單，容易推廣，這類方法目前技術(shù)雖未成熟，存在起療效短、免疫排斥及安全性等問題，但它是基因轉(zhuǎn)移研究的方向，只有in vivo基因轉(zhuǎn)移方法成熟了，基因治療才能真正走向臨床［2］。另外由于椎間盤髓核細(xì)胞處于一種高封閉狀態(tài)，故選擇直接體內(nèi)的轉(zhuǎn)染方法可以基本達(dá)到對靶細(xì)胞的較高選擇，有利于保持高濃度的目的基因載體。(2)載體DNA的選擇:目前，基因治療所采用的載體很多，大體上可以分成兩大類:病毒載體類和非病毒載體類。前者容量大、效率高、滴度穩(wěn)定，但在技術(shù)上有待成熟，且由于其含有病毒蛋白，容易引起宿主體內(nèi)的不良反應(yīng)，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。相對于前者，后者雖然轉(zhuǎn)移效率低，持續(xù)時間短，組織特異性不強，但通過采用特異性啟動子(如CMV)和增強子以及修飾識別蛋白的方法可以提高其靶向性。而且非病毒載體易于操作、純化，可以根據(jù)目的基因的大小來選擇有不同容量的真核表達(dá)載體，沒有DNA整合和產(chǎn)生野病毒的危險，無免疫反應(yīng)等。質(zhì)粒載體的優(yōu)點在于便于制備，安全性好，缺點在于體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高轉(zhuǎn)染效率的質(zhì)粒越來越受青睞［3］。

3.3 髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性基因后表達(dá)的持續(xù)性 綜合文獻(xiàn)報道，在體實驗中，Nishida等［4］采用腺病毒作為載體攜帶hTGF-β1基因轉(zhuǎn)染兔椎間盤髓核細(xì)胞僅報道了1周的結(jié)果，國內(nèi)實驗室雖然對體外培養(yǎng)退變椎間盤髓核細(xì)胞進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)染獲得較高的表達(dá)，但未能進(jìn)行細(xì)胞的傳代。體外轉(zhuǎn)染椎間盤軟骨終板的軟骨細(xì)胞，只有1%～3%細(xì)胞出現(xiàn)了標(biāo)記基因表達(dá)的陽性染色。由于基因表達(dá)的調(diào)控是一個多層次，多水平的復(fù)雜過程，其中包括基因組、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后等多種水平，所以椎間盤退變的研究要從多個層次尋找高效、長期的目的基因表達(dá)方法。

1 張雷，胡有谷.hTGF-β1基因治療腰椎間盤退變研究進(jìn)展.中華矯形外科雜志，2001，12:1216-1218.

2 Evans CH，Robbins PD.Genetically augmented tissue engimeering of the musculo-skeletal system.Cline Orthop，2003，367:410-418.

3 張維康，徐杰.瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1基因轉(zhuǎn)移對實體瘤的治療作用.中華實驗外科雜志，2003，15:507-509.

4 Nishida K，Kang JD，Gilbertson LG，et al.1999 volvo award winer in basic science studis:modulstion of the biologic activity of the rabbit intervertebral disc by gene therapy;an in vivo study of adenovirus mediated transfer of the human transforming growth factor β1encoding gene.Spine，2002，24:2419-2425.