李彩芳，楊建平，王麗娜，劉 磊，胡計嬅，劉思蘭

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，江蘇蘇州 215006)

2002年第10屆世界疼痛學會將疼痛列為心率、血壓、體溫和呼吸后的第五大生命體征。疼痛，尤其是慢性疼痛，正越來越嚴重的影響著患者的生活質量。在所有慢性疼痛患者中，最急需治療的是癌痛患者，因此，對癌痛的治療及產生機制的研究越來越重要。細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulate kinase，ERK)是 MAPK家族中的一員，介導多種信號的胞內轉導，已在不同的疼痛模型中發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK表達增加，用其上游激酶MEK的阻滯劑能減輕模型大鼠的痛敏表現(xiàn)，提示其活性的變化與傷害性刺激的傳遞及神經敏感化有關［1－2］。本研究擬觀察鞘內注射絲裂原激活蛋白激酶激酶(MEK)阻滯劑U0126對骨癌痛(bone cancer pain，BCP)大鼠痛行為和脊髓背角磷酸化CREB(pCREB)表達的影響，探討ERK-CREB通路在骨癌痛中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物成年♀Sprague-Dawley大鼠，體質量150～180 g，由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。許可證號SYXK(蘇)2007-0035。動物在適應環(huán)境1周后開始實驗。實驗室光照時間08:00～20:00，溫度控制在(18～22)℃，濕度40% ～60%。單籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食。所有實驗均在光照期間完成。

1.2主要藥品和儀器U0126(Sigma公司，USA);兔抗pCREB抗體、免疫組化試劑盒(Santa Cruz公司，USA)。Von-Frey毛針觸痛覺檢測儀 (BME-403，中國醫(yī)學科學院生物工程研究所);Walker256細胞為本實驗室凍存;溶媒為5%二甲亞砜(DMSO)。

1.3方法

1.3.1建造大鼠骨癌痛模型按照本實驗室方法［3］建立大鼠骨癌痛動物模型，大鼠脛骨干骺端打孔向骨髓腔緩慢注入Walker256細胞懸液制作成功。術后分籠飼養(yǎng)。室溫維持20～25℃，自然照明，自由飲水和攝食。假模型組以相同容量Hanks液代替細胞懸液。

1.3.2大鼠脊髓蛛網膜下腔置管骨癌痛模型術后 2 d，大鼠用水合氯醛(350 mg·kg－1，ip)麻醉后，根據楊建平等［4］的方法并加以改進，進行蛛網膜下腔置管，采用L3～4法。大鼠單籠飼養(yǎng)。出現(xiàn)下肢跛行癱瘓、局部感染、活動異常、導管脫落等異常的大鼠及其數(shù)據摒棄不用。

1.4第一部分分組和觀察指標

1.4.1分組40只大鼠，隨機均分為5組(n=8):Ⅰ組在大鼠脛骨注Hanks液制作為假模型組，單次鞘內注射10 μg U0126，組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ在大鼠脛骨注腫瘤細胞制作骨癌痛動物模型10 d后分別鞘內注射 5% 二甲亞砜(DMSO)10 μl和 U0126 0.1、1、10 μg(均溶于 10 μl 5%DMSO)。

1.4.2行為學測定造模術前及術后1、3、5、7、9 d測定大鼠雙側后肢機械性縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。每天早、中、晚測3次，取平均值。鞘內給藥后 1、3、6、9、24 h測定大鼠術側后肢的機械性縮爪閾值。機械性痛敏采用Chaplan等［5］的方法測定50%縮足閾值，大鼠適應環(huán)境30 min后用一系列von Frey毛針觸痛覺檢測儀刺激雙側后肢足底中部，如大鼠在刺激時或移開von Frey纖維絲時出現(xiàn)快速縮足或舔足反應為陽性反應，每次間隔30 s，以15 g為上限。用天平和有機玻璃自制成大鼠后肢負重測量儀，取兩后肢負重差(weight bearing different，WBD)，左右分別測量3次，兩次實驗之間至少間隔5 min，取平均值［6］。

1.5第二部分分組和觀察指標

1.5.1分組25只大鼠，隨機平分為5組(n=5):T1、T2和T3組在制作大鼠骨癌痛動物模型10 d后，鞘內注射 U0126 10 μg 后 1、6、24 h 處死大鼠取材，M組為模型對照組，鞘內注射5%DMSO 10 μl后6 h處死大鼠，另5只在大鼠脛骨注Hanks液制作為假模型大鼠作為空白對照組(S組)，鞘內注射5%DMSO 10 μl后6 h 處死取材。

1.5.2免疫組織化學采用免疫組織化學方法測定術側脊髓背角pCREB免疫反應陽性神經元數(shù)量。大鼠腹腔注射水合氯醛400 mg·kg－1深麻醉后，經主動脈灌注生理鹽水100 ml，4%多聚甲醛400 ml繼續(xù)灌注，取L4-5脊髓，在丙酮中后固定3 h。采用KEDEE KD-Ⅱ型冰凍切片機(浙江金華)將脊髓制成30 μm 切片，將切片收集在0.01·mol·L－1PBS中，破膜劑Triton×100破膜5 min，3%過氧化氫25 min，漂洗后5%正常羊血清室溫孵育，再漂洗后滴加兔抗pCREB(1∶400)(Santa Cruz公司，美國)，4℃孵育24 h后，PBS沖洗，滴加生物素標記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h后PBS沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育2 h后PBS沖洗，DAB顯色，貼片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。陰性對照實驗中，用PBS代替一抗或二抗。進行pCREB陽性神經元計數(shù)。

1.6統(tǒng)計學處理計量資料以±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 MWT測定骨癌痛組(Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)術后7 d及以后MWT較假模型組(Ⅰ)明顯下降。Ⅰ組大鼠鞘內注射U0126 10 μg后對MWT沒有影響。Ⅳ組在用藥后6 h、Ⅴ組用藥后3、6 h和9 h與Ⅱ組MWT比較有明顯差異，提示鞘內注射U0126 10 μg后可減輕骨癌痛所致的機械性痛敏，作用可持續(xù)至用藥后9 h。見Fig 1。

Fig 1 Changes of MWT in different time points before and after model made(±s，n=8)

2.2WBD測定Ⅰ組大鼠鞘內注射U0126 10 μg后對WBD沒有影響。骨癌痛組(Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)術后7 d及以后WBD較假模型組明顯增高。Ⅱ組鞘內注射5%二甲亞砜10 μl后WBD無變化，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組鞘內應用不同劑量U0126后3、6 h和9 h較用藥前時點的WBD減小，差別有統(tǒng)計學意義。用藥后24 h后與用藥前時點的WBD比較無統(tǒng)計學意義。見Fig 2。

Fig 2 Changes of WBD in different time points before and after model made(±s，n=8)

2.3形態(tài)學免疫組化染色可見模型組大鼠與假模型組比較，脊髓背角內pCREB免疫陽性神經元增多，且多為雙側全層分布，多數(shù)pCREB陽性神經元位于背角淺層。鞘內注射10 μg U0126可以減少脊髓背角pCREB表達，于用藥后6 h表現(xiàn)最為明顯。見 Fig 3、4。

Fig 3 Changes in the positive cell numbers of pCREB in dorsal horn of the spinal cord in rats(±s，n=5)

3 討論

本實驗中，將腹水細胞傳代培養(yǎng)的Walker256癌細胞種植于同系的SD大鼠后肢脛骨上端骨髓腔以建立骨轉移性癌痛模型，造模術后7 d開始患側出現(xiàn)MWT進行性降低和WBD進行性增高，呈現(xiàn)明顯的機械性痛覺過敏和機械性痛覺超敏，提示模型制作成功。

以往的研究中，在不同的疼痛模型(辣椒素、完全氟氏佐劑致炎、內臟痛、電刺激等)均發(fā)現(xiàn)ERK通路參與了中樞敏感化的形成和發(fā)展［2－3，6－8］。U0126是一種常用的MAPKK(有絲分裂素激活蛋白激酶激酶)抑制劑，它可以通透細胞，與MEK非競爭結合，抑制活化酶的催化活力，從而阻止ERK1/2(即p44/42 MAPK)的磷酸化和激活。有研究證實，在炎性痛和病理性痛大鼠模型，鞘內注射MEK特異性阻滯劑U0126到背根神經節(jié)神經元能夠抑制背根神經節(jié)神經元細胞體ERK的磷酸化［7－8］。在本研究中，根據文獻［7］選擇3種不同劑量U0126及其溶劑5%DMSO對大鼠進行鞘內注射，發(fā)現(xiàn)5%DMSO對大鼠痛行為沒有影響，10 μg U0126可以明顯降低MWT，鞘內注射不同劑量U0126后對WBD的影響也有顯著性意義，由此可以看出，鞘內注射較大劑量MEK特異性阻滯劑U0126可以明顯減輕大鼠的痛行為，由此也可證實ERK通路參與了骨癌痛。

ERK可以轉位進入核內磷酸化轉錄因子CREB，調節(jié)目的基因的表達［9］，從而在痛覺敏化中發(fā)揮作用。其機制可能在于ERK被激活后從胞質移位到核內，激活Rsk2，接著將Ser133中的轉錄因子CREB磷酸化，CREB磷酸化后與DNA上啟動子區(qū)域中的cAMP反應元件位點結合，進而啟動基因轉錄［10］。CREB作為一種核內轉錄因子，參與多種生物分子基因表達的調控，其中的如c-fos、內啡肽、NK-1受體、COX-2、BDNF等的表達在各種傷害性刺激引起的脊髓神經元長時程可塑性變化中發(fā)揮重要作用［11－13］。本研究的免疫組化結果顯示，骨癌痛組大鼠脊髓背角pCREB表達較假模型組增多，鞘內注射U0126能明顯抑制模型組大鼠脊髓pCREB表達的增多，這種作用在用藥后6 h最為明顯，可以推測CREB可能參與介導了骨癌痛。

本研究中，骨癌痛組大鼠鞘內注射U0126后機械痛敏得到緩解，pCREB表達也明顯減少，但仍較假模型組高，這可能是由于其他機制如脊髓膠質細胞的活化［14］等也參與了骨癌痛的形成有關。

綜上所述，ERK及其下游的CREB可能參與介導了大鼠骨癌痛的形成與維持。

Fig 4 Different expression of pCREB in the dorsal horn of spinal cord in rats

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