馮玉奎，鄭長(zhǎng)青，孫英姿，高 波

乳酸桿菌（Lactobacillus）是在乳酸菌中與動(dòng)物關(guān)系最密切的菌屬，動(dòng)物和人類從口腔到直腸始終有該菌存在，是動(dòng)物腸道中占優(yōu)勢(shì)的菌群之一。當(dāng)動(dòng)物消化道中乳酸桿菌的比率下降，則動(dòng)物消化機(jī)能紊亂，嚴(yán)重者導(dǎo)致動(dòng)物腸炎、下痢等疾病。乳酸桿菌的數(shù)量變化往往預(yù)示著人身體狀態(tài)發(fā)生變化。因此確切了解乳酸桿菌變化及對(duì)乳酸桿菌進(jìn)行精確定量對(duì)疾病的診斷有著重要的意義[1-4]。

本研究依據(jù)乳酸桿菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)屬特異性引物，以常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后的質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)光譜定量、梯度稀釋后制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。抽提腸道菌群的細(xì)菌基因組DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量分析樣品中乳酸桿菌數(shù)量。

該項(xiàng)目完成后，有望建立一種高靈敏度的乳酸桿菌及腸道菌群定量檢測(cè)體系，該檢測(cè)體系將為定量檢測(cè)乳酸桿菌提供有效的實(shí)驗(yàn)手段，并為相關(guān)檢測(cè)試劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣品 40份成年健康人糞便。用無菌離心管收集其糞便標(biāo)本，置在-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.1.2 工具酶和試劑 Genomic DNA purification kit、Gel and PCR clean-up system、質(zhì)粒小量純化試劑盒購自購自Promega公司；RealMasterMix(SYBR Green)為北京天根公司產(chǎn)品；pMD18simple-T vector、ExTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000等購自日本TAKARA生物工程公司；MRS培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器 本研究中所用的定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀。

1.2 乳酸桿菌的傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù) 乳酸桿菌的活菌計(jì)數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)方法精確取0.1 g糞便利用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)[5]。

1.3 FQ-PCR引物的設(shè)計(jì) 利用DNAMAN引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增乳酸桿菌的引物。所選用的上下游引物如下， 引物 1：5'CTGATG AAAGCCCTCG3'；引物 2：5-GAGCCTCAGCGTCAGTG 3'； 擴(kuò)增片段為230bp。引物序列經(jīng)過BLAST檢索（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），具有很強(qiáng)的特異性。引物由北京三博遠(yuǎn)志有限公司合成。

1.4 病原菌DNA的提取 糞便標(biāo)本于常溫下融凍，取0.1 g大便，加10 ml磷酸鹽緩沖液，充分混勻5 min；1000 r/min離心 10 min，取上清液，利用Promega公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行，過程參照其說明書。所有乳酸桿菌基因組DNA，于-20℃保存。

1.5 常規(guī)PCR反應(yīng) 取乳酸桿菌基因組DNA抽提液進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為50 μl，10×PCR buffer 5 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 4 μl，上、下游引物各10pmol，Ex Taq DNA聚合酶2.5U，加去離子水至50 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min；94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，循環(huán) 42次；72℃延伸5 min。在擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物10 μl與DNA Marker DL 2000同時(shí)進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收并與pMD18simple-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Top10，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取4個(gè)白色克隆，菌落PCR鑒定得到陽性克隆后，小量制備質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行PCR鑒定并送北京華大中生公司測(cè)序。用紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量后，根據(jù)以下公式計(jì)算出其拷貝數(shù)，進(jìn)行10倍梯度稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乳酸桿菌的數(shù)量

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)在 20 μl體系中進(jìn)行， 包括 RealMasterMix（SYBR Green）9 μl，模板 1 μl，上、下游引物各 10 pmol，加無菌去離子水至20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min；94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s， 循環(huán)42次；read plates，72℃延伸5 min。用起始模板拷貝數(shù)的lg值對(duì)每個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的CT值繪圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 乳酸桿菌數(shù)量的測(cè)定 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，對(duì)40份乳酸桿菌基因組DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（不加模板）及陽性對(duì)照。根據(jù)測(cè)得的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中DNA拷貝數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以 x（lgx）±s（lgx）表示，采用單因素方差分析方法分析熒光定量PCR和傳統(tǒng)培養(yǎng)對(duì)于乳酸桿菌定量的差別。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期約230bp，結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)以104～108copies/μl的梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線如圖2，標(biāo)準(zhǔn)品熔點(diǎn)曲線如圖3，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸相關(guān)系數(shù)r=－0.996 6。

圖2 乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖3 乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品熔點(diǎn)曲線

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 檢測(cè)樣品中DNA數(shù)量的測(cè)定 各糞便樣品基因組DNA用定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每克標(biāo)本中乳酸桿菌的數(shù)量。與培養(yǎng)法相比，熒光定量PCR檢測(cè)所得結(jié)果與培養(yǎng)方法獲得的結(jié)果接近（P>0.05）。見表1。

表1 兩種方法所得結(jié)果（±s拷貝數(shù)/g濕便）

表1 兩種方法所得結(jié)果（±s拷貝數(shù)/g濕便）

細(xì)菌 定量PCR法 培養(yǎng)法 T值 P值乳酸桿菌 9.3±1.5 8.9±1.3 1.215 0.087

3 討 論

FQ-PCR技術(shù)創(chuàng)立于1996年，由美國Applied Biosystems公司推出，是一種在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。FQ-PCR技術(shù)是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。FQ-PCR技術(shù)融合PCR技術(shù)和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化使PCR的擴(kuò)增及其分析過程均在同一封閉系統(tǒng)下完成，并在電腦分析軟件支持下實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和自動(dòng)定量，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、疾病診斷、食品、水質(zhì)環(huán)保、藥物開發(fā)等領(lǐng)域，被認(rèn)為是核酸定量的金標(biāo)準(zhǔn)[6，7]。

腸道菌群的微生態(tài)平衡與人的健康及疾病有著密切的關(guān)系[8-10]。正常人腸道中的菌群，主要為厭氧菌，少數(shù)為需氧菌，前者約為后者的100倍。存在于腸道的正常菌群為類桿菌、乳桿菌、大腸桿菌和腸球菌等，尚有少數(shù)過路菌，如金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、白色念珠菌等。在正常情況下，這些微生物互相依存，互相制約，維持平衡，保持一定的數(shù)量和比例[11-13]。在人體抵抗力降低的情況下，如瘦弱嬰幼兒，年老體弱和患急、慢性疾病者，以及長(zhǎng)期、大量使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物和放射治療者，尤其是應(yīng)用廣譜抗生素者，可使腸道正常菌群被抑制而數(shù)量減少，耐藥的過路菌過量繁殖，造成腸道菌群失調(diào)。出現(xiàn)臨床癥狀者，稱為腸道菌群失調(diào)癥[14-17]。因此確切了解腸道菌群變化及對(duì)腸道菌群進(jìn)行精確定量對(duì)疾病的診斷有著重要的意義。

傳統(tǒng)的乳酸桿菌檢測(cè)方法是基于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)特征，在特殊培養(yǎng)基上經(jīng)厭氧培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)來實(shí)現(xiàn)的，其過程易受細(xì)菌離體時(shí)間、外界環(huán)境因素、培養(yǎng)基性能和非特異性菌落混雜等多種因素影響，檢測(cè)失敗率高，結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，計(jì)數(shù)不精確，屬半定量檢測(cè)。

本研究應(yīng)用熒光定量PCR的方法對(duì)健康人群的腸道菌群中的乳酸桿菌進(jìn)行了定量分析，并和傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較。其結(jié)果和其它文獻(xiàn)報(bào)道的用培養(yǎng)的方法得到的結(jié)果接近，也說明了熒光定量PCR法可以準(zhǔn)確特異地對(duì)腸道菌群進(jìn)行定量。此技術(shù)為進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人腸道菌群的組成及其動(dòng)態(tài)變化提供了有效的檢測(cè)手段，具有較好的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用的前景。

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