姚虎勝，易 克，楊陟華，朱茂祥

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南中煙工業(yè)有限責任公司原料采購中心，湖南 長沙 410014；3.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850）

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤,已成為目前癌癥死亡的首要病例。流行病學調(diào)查表明，多種人類廣泛接觸的因素與肺癌的發(fā)生有關[1]，目前公認吸煙是引起肺癌的首要因素[2]?，F(xiàn)代生物學試驗與流行病學研究表明，腫瘤發(fā)生與細胞基因突變有關，其發(fā)展呈階段過程，即啟動、促癌和發(fā)展等3個過程。因此，從基因水平上研究支氣管上皮細胞對卷煙煙氣的反應及細胞的惡性轉(zhuǎn)化過程是腫瘤研究的關鍵所在。研究表明，TG2參與多種生理過程且與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[3-5]，目前對TG2的研究主要集中在腫瘤發(fā)生后，研究對腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤、治療及預后的影響，所用材料大多都是腫瘤細胞[6-8]。本試驗所用材料為惡性轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細胞，研究的時期為腫瘤發(fā)生的早期事件（即細胞的惡性轉(zhuǎn)化階段），以期為吸煙致肺癌的早期診斷提供一些依據(jù)，同時也提供一個腫瘤早期治療的分子標靶。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

LHC-8完全培養(yǎng)液（美國Gibical公司）；Kentukey Reference 2R4F卷煙（University of Kentucky）；TG2一級抗體（Abcam公司）；TG2活性檢測試劑盒（Sigma公司）；增殖檢測試劑盒（Invitrogen公司）；凋亡檢測試劑盒（invitrogen公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；酶標儀（BIO-RAD 860）；流式細胞儀（FACSCalibur，BD Bioscience公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 卷煙煙氣總粒相物（TPM）的制備 TPM收集方法參考按國家標準GB/T 5606.1-2004、GB/T19609-2004、GB/T 16447-2004。所需受試樣品抽吸完后，空吸3口，劍橋濾片（直徑44 mm）收集TPM，用DMSO溶解備用，調(diào)整濃度為10 mg/mL。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人乳頭瘤病毒（HPV-18）永生化的人支氣管上皮細胞（BEP2D細胞）由軍事醫(yī)學科學院提供，用LHC-8無血清培養(yǎng)液、37.5℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 細胞存活率檢測 以MTT法檢測BEP2D細胞存活率[8]。細胞存活率計算方法見式（1）。

1.2.4 Western-blot分析 收獲BEP2D細胞，提取蛋白質(zhì)，各上樣30 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用第二抗體偶聯(lián)物進行免疫檢測，發(fā)光底物顯跡法顯跡。在暗室中用感光膠片進行放射自顯影，經(jīng)顯影、定影后分析雜交信號。分析的信號為整合的光密度值（OD）。試驗重復3次，統(tǒng)計學檢驗用單側(cè)t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學顯著性。

1.2.5 TG2活性檢測、細胞凋亡試驗、細胞增殖試驗、細胞周期試驗 以上試驗均按所購試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞存活試驗

細胞存活率如圖1所示。由圖1A可以看出，TPM與細胞存活劑量效應關系明顯，根據(jù)量效曲線計算 2R4F的 IC50為 132 μg/mL。圖 1B 為 60 μg/mL TPM濃度下，不同染毒時間對細胞存活率的影響，可以看出小于24 h時存活率>80%,因此選取10、30、60 μg/mL（存活率>80%）作為染毒劑量。

圖1 TPM處理對BEP2D細胞相對存活率的影響

2.2 Western-Blot試驗

由圖2可以看出，隨著TPM濃度升高，BEP2D細胞中TG2蛋白的表達量呈下降趨勢，說明單次染毒就能使BEP2D細胞中TG2蛋白表達下調(diào)。由圖3可以看出，P40(染毒40代的BEP2D細胞)的TG2蛋白表達明顯減少，而P40細胞RA（TG2激活劑）處理后TG2蛋白表達水平基本恢復到正常細胞水平。

圖2 不同劑量TPM處理24 h后BEP2D細胞中TG2蛋白表達情況

圖3 不同類型BEP2D細胞中TG2蛋白表達情況

2.3 TG2活性檢測試驗

由圖4可以看出，TPM 60 μg/mL時，隨著染毒時間延長，TG2蛋白活性呈下降趨勢，12 h達到最低值，24、36 h時較12 h有一定回升，但均低于空白對照的50%；而染毒24 h，隨著染毒劑量增大，TG2活性呈明顯下降趨勢，這與Western-Blot的結(jié)果一致。由圖5A可以看出，P40細胞中TG2活性比正常細胞的低，而RA處理后細胞中TG2活性基本恢復到正常細胞水平，與Western-Blot的結(jié)果一致。由圖5 B可以看出，TPM及MDC[Monodansylcadaverine，丹(磺)酰戊二胺]均能使細胞中TG2活性下降，而同時處理則不能使TG2活性進一步下降。

圖4 BEP2D細胞TPM60 μg/mL不同染毒時間、24 h不同染毒劑量對TG2蛋白活性的影響

圖5 不同細胞及處理TG2蛋白活性變化情況

2.4 細胞凋亡試驗

通過Annexin V/PI染色方法，可以檢測早期細胞凋亡。從早期凋亡的統(tǒng)計結(jié)果，可以明顯看出（圖6），P40和正常細胞的自發(fā)凋亡相差無幾，而加TPM刺激時，兩者細胞的凋亡率均上升，其中正常細胞+TPM的凋亡率比P40+TPM上升得更多，這可能與P40細胞已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化有關。而P40加RA刺激后（TG2活性增強），凋亡明顯增強 ，說明TG2在細胞惡性轉(zhuǎn)化后對細胞的凋亡有很大影響（促進凋亡）。正常細胞加MDC處理后（TG2活性下降）無明顯變化，可能和TPM+MDC處理與TPM單獨處理對TG2活性影響差不多，也可能與正常細胞中TG2活性對細胞凋亡的調(diào)控作用有限有關。

圖6 早期凋亡結(jié)果

2.5 細胞增殖試驗

CFSE染色可以檢測不同細胞及處理的增殖情況。CFSE染色后，每分裂一次，熒光強度減半，通過熒光強度的幾何平均值就可判斷細胞增殖的情況，增殖越快，熒光強度的幾何平均值越低。由表1可以看出，P40細胞和正常細胞相比，熒光強度的幾何平均值變小，說明惡性化的P40增殖速度較正常細胞明顯加快，而P40細胞加RA處理后，熒光強度向正常細胞回復，熒光強度的幾何平均值幾乎回復到正常細胞水平。而正常細胞加MDC處理（TG2表達下調(diào)）同樣能使細胞使熒光強度減少，增殖加快。這說明TG2的活性在正常細胞及惡性轉(zhuǎn)化細胞中都對細胞增殖起重要的調(diào)控作用。

表1 處理24 h后CFSE熒光強度（幾何平均值）

2.6 細胞周期試驗

采用流式細胞儀分析正常組、P40組、正常組加MDC處理組、P40加RA處理組細胞周期各時相的比例見表2。P40組和正常組比較，G0G1期所占比例明顯減少，P40加RA處理后向正常組回復，而正常組加MDC處理后變化無統(tǒng)計學意義。這說明TG2活性對惡性轉(zhuǎn)化BEP2D細胞周期調(diào)控作用明顯，而對正常細胞的周期調(diào)控不明顯。

表2 處理24 h后周期分布 （%）

3 討論與結(jié)論

惡性轉(zhuǎn)化的BEP2D細胞中TG2表達下調(diào)，并且CSC單次刺激BEP2D細胞也可導致TG2表達下調(diào)。通過TG2的激活劑和抑制劑調(diào)控TG2的活性，發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化P40細胞中TG2下調(diào)，周期、增殖、凋亡異常，可見改變TG2活性能夠改變P40細胞的周期、增殖、凋亡。這說明TG2可能通過上述幾個生理過程影響細胞的惡性程度。正常細胞中TG2表達及活性改變對細胞的周期、增殖、凋亡影響不明顯，可能在惡性化過程中影響因素很多，TG2只是其中一個因素，不足以決定細胞惡性轉(zhuǎn)化。

[1] Geneva.Reducing Risks,Promoting Healthy Life[A].World Health Organization,The World Health Report[C].2002.

[2] WHO.Tobacco or health:a global status report[M].Geneva:WHO,1997.10-48.

[3] Yuan L,Behdad A,Siegel M,et al.Tissue transgluaminase 2 expression in meningiomas[J].J Neurooncol,2008,Nov;90（2）：125-32.Epub,2008,Jun 28.

[4] Thomázy V,Fésüs L.Differential expression of tissue transglutaminase in human cells[J].Cell Tissue Res,1989,Jan;255（1）:215-24.

[5] Jeon J H,Cho S Y,Kim C W,et al.GTP is required to stabilizeand display transamidation activity of transglutaminase 2[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,Jun 21;294（4）:818-22.

[6] Robitaille K,Daviau A,Lachance G,et al.Calphostin C-induced apoptosis is mediated by a tissue transglutaminase-dependent mechanism involving the DLK/JNK signaling pathway[J].Cell Death Differ,2008,Sep;15（9）:1522-31.Epub,2008,May 23.

[7] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J.Immunol.Methods,1983,65:55-63.