姚虎勝，易 克，楊陟華，朱茂祥

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司原料采購(gòu)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410014；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

肺癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤,已成為目前癌癥死亡的首要病例。流行病學(xué)調(diào)查表明，多種人類廣泛接觸的因素與肺癌的發(fā)生有關(guān)[1]，目前公認(rèn)吸煙是引起肺癌的首要因素[2]?，F(xiàn)代生物學(xué)試驗(yàn)與流行病學(xué)研究表明，腫瘤發(fā)生與細(xì)胞基因突變有關(guān)，其發(fā)展呈階段過(guò)程，即啟動(dòng)、促癌和發(fā)展等3個(gè)過(guò)程。因此，從基因水平上研究支氣管上皮細(xì)胞對(duì)卷煙煙氣的反應(yīng)及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程是腫瘤研究的關(guān)鍵所在。研究表明，TG2參與多種生理過(guò)程且與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3-5]，目前對(duì)TG2的研究主要集中在腫瘤發(fā)生后，研究對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)、治療及預(yù)后的影響，所用材料大多都是腫瘤細(xì)胞[6-8]。本試驗(yàn)所用材料為惡性轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞，研究的時(shí)期為腫瘤發(fā)生的早期事件（即細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化階段），以期為吸煙致肺癌的早期診斷提供一些依據(jù)，同時(shí)也提供一個(gè)腫瘤早期治療的分子標(biāo)靶。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

LHC-8完全培養(yǎng)液（美國(guó)Gibical公司）；Kentukey Reference 2R4F卷煙（University of Kentucky）；TG2一級(jí)抗體（Abcam公司）；TG2活性檢測(cè)試劑盒（Sigma公司）；增殖檢測(cè)試劑盒（Invitrogen公司）；凋亡檢測(cè)試劑盒（invitrogen公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；酶標(biāo)儀（BIO-RAD 860）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD Bioscience公司）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卷煙煙氣總粒相物（TPM）的制備 TPM收集方法參考按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5606.1-2004、GB/T19609-2004、GB/T 16447-2004。所需受試樣品抽吸完后，空吸3口，劍橋?yàn)V片（直徑44 mm）收集TPM，用DMSO溶解備用，調(diào)整濃度為10 mg/mL。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳頭瘤病毒（HPV-18）永生化的人支氣管上皮細(xì)胞（BEP2D細(xì)胞）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，用LHC-8無(wú)血清培養(yǎng)液、37.5℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 以MTT法檢測(cè)BEP2D細(xì)胞存活率[8]。細(xì)胞存活率計(jì)算方法見(jiàn)式（1）。

1.2.4 Western-blot分析 收獲BEP2D細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，各上樣30 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用第二抗體偶聯(lián)物進(jìn)行免疫檢測(cè)，發(fā)光底物顯跡法顯跡。在暗室中用感光膠片進(jìn)行放射自顯影，經(jīng)顯影、定影后分析雜交信號(hào)。分析的信號(hào)為整合的光密度值（OD）。試驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)用單側(cè)t檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

1.2.5 TG2活性檢測(cè)、細(xì)胞凋亡試驗(yàn)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞周期試驗(yàn) 以上試驗(yàn)均按所購(gòu)試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞存活試驗(yàn)

細(xì)胞存活率如圖1所示。由圖1A可以看出，TPM與細(xì)胞存活劑量效應(yīng)關(guān)系明顯，根據(jù)量效曲線計(jì)算 2R4F的 IC50為 132 μg/mL。圖 1B 為 60 μg/mL TPM濃度下，不同染毒時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響，可以看出小于24 h時(shí)存活率>80%,因此選取10、30、60 μg/mL（存活率>80%）作為染毒劑量。

圖1 TPM處理對(duì)BEP2D細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

2.2 Western-Blot試驗(yàn)

由圖2可以看出，隨著TPM濃度升高，BEP2D細(xì)胞中TG2蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明單次染毒就能使BEP2D細(xì)胞中TG2蛋白表達(dá)下調(diào)。由圖3可以看出，P40(染毒40代的BEP2D細(xì)胞)的TG2蛋白表達(dá)明顯減少，而P40細(xì)胞RA（TG2激活劑）處理后TG2蛋白表達(dá)水平基本恢復(fù)到正常細(xì)胞水平。

圖2 不同劑量TPM處理24 h后BEP2D細(xì)胞中TG2蛋白表達(dá)情況

圖3 不同類型BEP2D細(xì)胞中TG2蛋白表達(dá)情況

2.3 TG2活性檢測(cè)試驗(yàn)

由圖4可以看出，TPM 60 μg/mL時(shí)，隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，TG2蛋白活性呈下降趨勢(shì)，12 h達(dá)到最低值，24、36 h時(shí)較12 h有一定回升，但均低于空白對(duì)照的50%；而染毒24 h，隨著染毒劑量增大，TG2活性呈明顯下降趨勢(shì)，這與Western-Blot的結(jié)果一致。由圖5A可以看出，P40細(xì)胞中TG2活性比正常細(xì)胞的低，而RA處理后細(xì)胞中TG2活性基本恢復(fù)到正常細(xì)胞水平，與Western-Blot的結(jié)果一致。由圖5 B可以看出，TPM及MDC[Monodansylcadaverine，丹(磺)酰戊二胺]均能使細(xì)胞中TG2活性下降，而同時(shí)處理則不能使TG2活性進(jìn)一步下降。

圖4 BEP2D細(xì)胞TPM60 μg/mL不同染毒時(shí)間、24 h不同染毒劑量對(duì)TG2蛋白活性的影響

圖5 不同細(xì)胞及處理TG2蛋白活性變化情況

2.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

通過(guò)Annexin V/PI染色方法，可以檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。從早期凋亡的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，可以明顯看出（圖6），P40和正常細(xì)胞的自發(fā)凋亡相差無(wú)幾，而加TPM刺激時(shí)，兩者細(xì)胞的凋亡率均上升，其中正常細(xì)胞+TPM的凋亡率比P40+TPM上升得更多，這可能與P40細(xì)胞已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。而P40加RA刺激后（TG2活性增強(qiáng)），凋亡明顯增強(qiáng) ，說(shuō)明TG2在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后對(duì)細(xì)胞的凋亡有很大影響（促進(jìn)凋亡）。正常細(xì)胞加MDC處理后（TG2活性下降）無(wú)明顯變化，可能和TPM+MDC處理與TPM單獨(dú)處理對(duì)TG2活性影響差不多，也可能與正常細(xì)胞中TG2活性對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用有限有關(guān)。

圖6 早期凋亡結(jié)果

2.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

CFSE染色可以檢測(cè)不同細(xì)胞及處理的增殖情況。CFSE染色后，每分裂一次，熒光強(qiáng)度減半，通過(guò)熒光強(qiáng)度的幾何平均值就可判斷細(xì)胞增殖的情況，增殖越快，熒光強(qiáng)度的幾何平均值越低。由表1可以看出，P40細(xì)胞和正常細(xì)胞相比，熒光強(qiáng)度的幾何平均值變小，說(shuō)明惡性化的P40增殖速度較正常細(xì)胞明顯加快，而P40細(xì)胞加RA處理后，熒光強(qiáng)度向正常細(xì)胞回復(fù)，熒光強(qiáng)度的幾何平均值幾乎回復(fù)到正常細(xì)胞水平。而正常細(xì)胞加MDC處理（TG2表達(dá)下調(diào)）同樣能使細(xì)胞使熒光強(qiáng)度減少，增殖加快。這說(shuō)明TG2的活性在正常細(xì)胞及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中都對(duì)細(xì)胞增殖起重要的調(diào)控作用。

表1 處理24 h后CFSE熒光強(qiáng)度（幾何平均值）

2.6 細(xì)胞周期試驗(yàn)

采用流式細(xì)胞儀分析正常組、P40組、正常組加MDC處理組、P40加RA處理組細(xì)胞周期各時(shí)相的比例見(jiàn)表2。P40組和正常組比較，G0G1期所占比例明顯減少，P40加RA處理后向正常組回復(fù)，而正常組加MDC處理后變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明TG2活性對(duì)惡性轉(zhuǎn)化BEP2D細(xì)胞周期調(diào)控作用明顯，而對(duì)正常細(xì)胞的周期調(diào)控不明顯。

表2 處理24 h后周期分布 （%）

3 討論與結(jié)論

惡性轉(zhuǎn)化的BEP2D細(xì)胞中TG2表達(dá)下調(diào)，并且CSC單次刺激BEP2D細(xì)胞也可導(dǎo)致TG2表達(dá)下調(diào)。通過(guò)TG2的激活劑和抑制劑調(diào)控TG2的活性，發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化P40細(xì)胞中TG2下調(diào)，周期、增殖、凋亡異常，可見(jiàn)改變TG2活性能夠改變P40細(xì)胞的周期、增殖、凋亡。這說(shuō)明TG2可能通過(guò)上述幾個(gè)生理過(guò)程影響細(xì)胞的惡性程度。正常細(xì)胞中TG2表達(dá)及活性改變對(duì)細(xì)胞的周期、增殖、凋亡影響不明顯，可能在惡性化過(guò)程中影響因素很多，TG2只是其中一個(gè)因素，不足以決定細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

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