王紅芳 李菁 王明霞

革蘭陰性細菌菌體自溶或被裂解時會釋放細菌內(nèi)毒素(LPS)，而且在革蘭陰性細菌生長繁殖過程中，內(nèi)毒素也會不斷地從細菌外膜上脫落下來并釋放到周圍的介質(zhì)中［1］。多種研究證實，LPS不僅是決定革蘭陰性細菌感染的主要致病因素，還與人類其他許多疾病關(guān)系密切。目前，研究最為明確的LPS相關(guān)疾病是革蘭陰性細菌所導致的膿毒癥或感染性休克［1－3］。隨著有創(chuàng)技術(shù)、免疫抑制劑、化療尤其大量廣譜抗生素的使用增多，膿毒癥及感染性休克的發(fā)病率自20世紀50年代以來呈增多趨勢，現(xiàn)代流行病學統(tǒng)計結(jié)果，全世界每1000例患者中就有3例發(fā)生膿毒癥和感染性休克，同時這一數(shù)字還在以每年1.5% ～8%的速度上升。近年來，盡管抗感染治療技術(shù)取得了長足的進步，但病死率仍高居不下，已成為臨床醫(yī)學界急需破解的難題。本文就細菌內(nèi)毒素的危害性及其拮抗劑臨床研究進展做一綜述。

1 細菌內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)

細菌內(nèi)毒素又為脂多糖(LPS)，與蛋白質(zhì)及磷脂等一起構(gòu)成革蘭陰性菌的外膜，LPS的分子結(jié)構(gòu)可以分為3個區(qū)域:O-特異性多糖鏈(也稱為O-抗原)、核心多糖以及類脂A(Lipid A)［4］(圖1)。其中，O-特異性多糖鏈突出于膜外 5 ～10 nm，在菌體表面呈游離狀態(tài)，其基部與核心多糖相連。核心多糖由內(nèi)核和外核構(gòu)成，內(nèi)核的內(nèi)側(cè)端以2-酮-3脫氧辛酸與類脂A相連。后者位于脂多糖的最內(nèi)側(cè)，并且嵌入細菌外膜雙層磷脂分子的外葉。類脂A是LPS結(jié)構(gòu)中最保守的成分，不存在種屬特異性，是LPS的主要生物活性成分。每個細菌表面分布的LPS分子數(shù)量不定，約占細菌外膜結(jié)構(gòu)的25%、外膜總表面積的75%。LPS單體的分子量多為5000～25000，由于LPS是由親水性的多糖和親脂性的類脂共同構(gòu)成的一種兩性大分子，此親水基團和疏水基團在空間結(jié)構(gòu)上位于分子的兩端，因此，LPS在極性溶劑和非極性溶劑中均能形成多聚體，在電鏡下呈清晰的微膠粒樣。單體LPS首先與血漿中的脂多糖蛋白(LBP)結(jié)合形成復合物，然后再與CD14結(jié)合才能產(chǎn)生生物學效應，而多聚體的LPS不能與CD14結(jié)合發(fā)揮生物活性。

圖1 細菌內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)示意圖

2 LPS的生物學危害

2.1 致熱性 LPS進入機體后，刺激產(chǎn)生內(nèi)生致熱原細胞(主要是單核巨噬細胞等)使其釋放內(nèi)源性致熱原［如白介素-1(IL-1)、白介素-2、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素及多種促炎性細胞因子］，這些內(nèi)源性致熱原作為基本信息分子以不同的途徑將發(fā)熱信號傳入體溫調(diào)節(jié)中樞［5］，使體溫調(diào)定點上移，通過傳出途徑調(diào)節(jié)效應器對全身產(chǎn)熱和散熱做出反應，使產(chǎn)熱大于散熱，體溫升高。LPS致發(fā)熱高度在一定范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)，并且有明顯的潛伏期，人靜脈注射2 ng/kg劑量時發(fā)熱潛伏期可長達90 min。由于LPS對熱具有穩(wěn)定性，所以一般滅菌方法不能將LPS徹底破壞，不易清除。

2.2 凝血系統(tǒng)被激活 內(nèi)毒素對凝血系統(tǒng)具有激活作用，與彌散性血管內(nèi)凝血息息相關(guān)。普遍認為，內(nèi)毒素引起血管內(nèi)凝血，是由于誘導單核細胞和血管內(nèi)皮細胞大量表達組織因子(TF)所致［6］。LPS首先與血漿中的LBP結(jié)合形成復合物，然后以復合物形式與單核/巨噬細胞以及血漿中的CD14結(jié)合，血漿中的這個大復合物再與血管內(nèi)皮細胞結(jié)合，近來發(fā)現(xiàn)在單核/巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞存在鐘樣受體(TLR)，為跨膜蛋白，其中的TLR 4主要識別并結(jié)合LPS-CD14復合物。LPS-CD14復合物與TLR 4結(jié)合以后，相繼通過髓樣細胞分化因子88至IL-1受體相關(guān)激酶等一系列效應啟動TF基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及蛋白修飾，最后TF蛋白以跨膜形式存在或以小囊泡形式釋放。釋放的TF與血漿中的FⅦ及FⅦa立即結(jié)合成FⅦ/TF和FⅦa/TF，后者激活后和FⅨ生成FⅦa/TF復合物，F(xiàn)Ⅹa和FⅨa又可反饋活化FⅦ/TF成為FⅦa/TF。FⅩa可以催化凝血酶原形成凝血酶，完成體內(nèi)凝血過程的啟動階段。然后進入放大階段:少量的凝血酶活化血小板，使氨基磷脂由細胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)向外側(cè)，構(gòu)成凝血因子相互作用的催化表面。并且，少量的凝血酶還能活化FⅧ和FⅤ，F(xiàn)Ⅷa加速FⅨa對FⅩ的激活，F(xiàn)Ⅴa加速FⅩa對凝血酶原的激活。同時在活化的血小板表面，凝血酶激活FⅪ，于是FⅪa作為TF途徑與“截短的”內(nèi)源性途徑的連接點，通過后者就可以快速地生成足量的凝血酶，從而促進纖維蛋白轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而凝血以及血栓的形成。

2.3 對細胞代謝的影響 嚴重創(chuàng)傷感染、膿毒血癥可以導致機體出現(xiàn)包括體溫升高、體重減輕和能量損耗的超代謝反應［7］。其主要的致病因素是由LPS激活體內(nèi)多種髓系細胞如單核/巨噬細胞和非髓系細胞如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等，產(chǎn)生釋放TNF、IL-1、白介素-6(IL-6)、NO及PGE2等多種細胞因子，參與機體急性期反應所致。例如:LPS刺激巨噬細胞可以引發(fā)一系列細胞因子、趨化因子的高水平釋放，同時，巨噬細胞還通過高水平表達的黏附分子介導本身與其他細胞間的相互作用，啟動炎性反應;LPS通過作用于炎性相關(guān)細胞導致多種炎性介質(zhì)的釋放，后者反過來作用于肝實質(zhì)細胞而導致肝損傷［8，9］，而肝損傷是機體代謝障礙的本質(zhì);LPS還會導致肌細胞的過度降解等。最終導致機體出現(xiàn)對糖、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝異常，導致細胞能量的代謝障礙，最終導致細胞死亡。

2.4 與失控性炎癥的關(guān)系 失控性炎癥包括全身炎性反應綜合征、代償性抗炎反應綜合征和混合性拮抗反應綜合征等多個動態(tài)過程，臨床上最為常見的病理現(xiàn)象，是創(chuàng)傷后并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要機制。其中，參與炎性反應的重要物質(zhì)是細胞因子，它既是免疫系統(tǒng)的信息傳遞介質(zhì)，又是神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)間相互聯(lián)系的重要紐帶，這些細胞因子來源多樣，功能多種，在體內(nèi)構(gòu)成縱橫交錯、紛繁復雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)［10］。失控性炎癥本質(zhì)是由細胞因子鏈鎖反應導致的一種介質(zhì)病，而LPS是最常見的誘發(fā)失控性炎癥的主要因素之一，被認為是這個鏈鎖反應的“扳機”。LPS激活多種靶細胞如單核/巨噬細胞、粒細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞等，釋放多種細胞因子以及炎性介質(zhì)，其中干擾素、TNF以及某些白介素等與膿毒血癥的發(fā)病機制緊密關(guān)聯(lián);血栓素、血小板活化因子及補體系統(tǒng)的激活也與之相關(guān);另外，還有諸如黏附分子、激肽及熱休克蛋白、誘生型一氧化氮合酶等因子。此環(huán)節(jié)一經(jīng)觸發(fā)啟動，就會遵循自身規(guī)律發(fā)展下去，細胞因子網(wǎng)絡(luò)將作用于機體的多種組織、器官和系統(tǒng)，最重要的是免疫系統(tǒng)和血管內(nèi)皮系統(tǒng)，它們的激活將導致炎癥級聯(lián)反應，形成“瀑布”式反應。

3 內(nèi)毒素作用的拮抗劑

革蘭陰性細菌在感染部位生長繁殖，釋放的LPS進入血液可能會導致內(nèi)毒素血癥繼而引發(fā)膿毒癥，因此，在膿毒癥的早期，合理使用抗菌藥是必要的，但是細菌在被抗菌藥殺滅的同時，由于外膜裂解會釋放大量的LPS，而抗菌藥沒有對抗內(nèi)毒素的作用。在中期和晚期，由于抗菌藥的使用，大量細菌被殺滅，將加速內(nèi)毒素的釋放而加重病情，因此，在抗菌的同時，如何抑制細菌內(nèi)毒素的釋放或減緩內(nèi)毒素對機體的損傷具有重要的臨床實際意義。

3.1 多黏菌素B(polymyxin B) 多黏菌素是從多黏桿菌中分離的一類抗生素，用于臨床的有多黏菌素B(PMB)和多黏菌素E(PME)，PMB通過其具有疏水性的陽離子結(jié)構(gòu)與類脂A特異性結(jié)合，抑制LPS的生物活性?，F(xiàn)今，對多黏菌素的研究熱點之一在于將其作為LPS的吸附劑，Pusey CD 1991年在人工腎的基礎(chǔ)上，用活性炭、PMB與樹脂交聯(lián)制成透析柱，對內(nèi)毒素血癥模型的大鼠進行血液透析，結(jié)果證明，被覆有PMB和活性炭的透析柱可明顯降低模型大鼠中的LPS水平。李苑等［11］用固定有PMB短肽的聚苯乙烯微球?qū)?nèi)毒素血癥模型大鼠進行血液灌流實驗，觀察該吸附劑血液灌流清除血漿中內(nèi)毒素的功效。實驗結(jié)果表明，采用血液灌流吸附療法成功地清除動物模型血液中的內(nèi)毒素，而且，固定有多黏菌素B的特異吸附劑具有良好的血液相容性。目前，利用能與血液中LPS具有高親和力物質(zhì)所制備的各種透析裝置在臨床上已廣泛應用。

3.2 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid) 糖皮質(zhì)激素應用于重度感染的治療已久，目前，臨床較常用的有氫化可的松、潑尼松、甲潑尼松以及地塞米松等。在膿毒癥治療中，糖皮質(zhì)激素可以有效抑制LPS作用后多種細胞因子的產(chǎn)生，并直接穩(wěn)定溶酶體膜以及抑制PLA2的活性，但也有報道證實對膿毒癥及膿毒癥休克患者使用大劑量糖皮質(zhì)激素會產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用，且注入大量的糖皮質(zhì)激素并不能提高膿毒癥患者的生存率，還可能增加二次感染的幾率而使病情惡化。由于在膿毒血癥患者中腎上腺功能不足的發(fā)生率相當高，同時可能存在皮質(zhì)醇耐受，甚至會出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗綜合征，在給予低劑量糖皮質(zhì)激素后，可能會收到較好效果。Tsao等［12］研究表明在使用小劑量地塞米松(0.1 mg/kg)能顯著減弱由內(nèi)毒素導致的循環(huán)衰竭和腎衰竭，降低病死率。Keh等［13］也報道小劑量糖皮質(zhì)激素可糾正膿毒血癥休克患者的血流動力學紊亂，以及免疫調(diào)節(jié)作用，其抗炎作用明顯高于其對免疫功能的抑制作用，但對腎上腺功能良好的患者效果不明顯。因此，臨床上究竟采用多少劑量的糖皮質(zhì)激素或使用多大劑量的促腎上腺皮質(zhì)激素刺激腎上腺發(fā)揮功能來治療膿毒癥還需要進一步的研究。

3.3 陽離子抗微生物多肽(Cationic antimicrobial peptides)抗菌肽是由生物體產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的多肽，它們在一級結(jié)構(gòu)和長度上不盡相同，但分子表面均有親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域，分子量小，因富含精氨酸或賴氨酸，至少帶有2個正電荷。等電點8.9～10.7，具有較強的陽離子特征。

研究表明，抗菌肽尤其是來自脊椎動物的抗菌肽，抗菌譜廣，具有較強的直接殺滅有害微生物的作用［14］，同時還具有許多其他生物學功能。證據(jù)表明，許多抗菌肽并非直接殺滅細菌而是通過間接作用機制發(fā)揮抗感染作用［15］?？咕牡目筁PS作用機制復雜，它對于宿主具有平衡和調(diào)節(jié)炎癥應答的作用，抑制LPS誘導的前炎性基因的表達，阻止某些細胞因子如TNF等的釋放，同時產(chǎn)生和釋放多種趨化因子來維持其他前炎性應答，更為重要的是抗菌肽并不單獨作用于一個炎性調(diào)節(jié)子，而是作用于多種調(diào)節(jié)子，并有選擇性的增強或抑制某一個或某些免疫應答，使它們成為很有力的抗LPS因子［16－18］。

3.4 殺菌性/通透性增加蛋白 (bactericidal/permeability increasing protein，BPI)BPI對革蘭陰性桿菌具有殺菌和中和內(nèi)毒素的作用，從而抑制內(nèi)毒素刺激單核細胞產(chǎn)生細胞因子，但卻具有強大的殺菌和中和內(nèi)毒素的作用，故有“超級抗生素”之稱。BPI是存在于人中性粒細胞嗜天青顆粒中的蛋白質(zhì)，其在化學結(jié)構(gòu)上與血漿中內(nèi)毒素結(jié)合蛋白LBP具有同源性，在正常血液循環(huán)中BPI含量很低，大約是血漿中LBP的千分之一。天然BPI是由456個氨基酸殘基構(gòu)成的，相對分子量為55×103，等電點為pH值9.8，是一種能中和內(nèi)毒素的內(nèi)源性粒細胞蛋白質(zhì)，與LPS的類脂A具有高度的親和力，在較低濃度BPI就可以競爭性抑制LBP與LPS的結(jié)合，減少LPS-LBP復合物的形成及其向mCDl4等LPS受體的轉(zhuǎn)運，從而拮抗LPS誘導的細胞激活反應［19］。因此，BPI常被認為是LBP的天然拮抗劑和LPS的抑制劑。無論是在動物實驗，還是在臨床革蘭陰性細菌感染所致膿毒癥治療方面，BPI對革蘭陰性菌具有強大的殺傷力，拮抗LPS的生物學效應，這與BPI對細菌外膜上的LPS有高強度的親和力是密不可分的。

3.5 溶菌酶 (lysozyme) 人溶菌酶存在于眼淚、唾液、鼻黏液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、腎、淋巴組織中，1 ml眼淚中含 7 mg溶菌酶，1 ml乳汁中含 0.1 ～0.5 mg。人溶菌酶由130個氨基酸殘基組成，有4個 S-S鍵，分子量為14600，其活性部位在第78～115位的28個氨基酸殘基序列，其中9個氨基酸殘基具有殺菌活性。它是堿性蛋白，在體內(nèi)接近中性的pH環(huán)境下帶有大量正電荷，能與帶有負電荷的病毒蛋白結(jié)合，也可與LPS結(jié)合，具有抗病毒、抗細菌內(nèi)毒素的作用。人溶菌酶的活性約為蛋清溶菌酶活性的3倍。溶菌酶雖在人體內(nèi)分布廣泛但提取困難。目前已有人將其基因克隆到原核和真核生物中進行表達，利用DNA重組技術(shù)獲取人溶菌酶。

溶菌酶廣泛存在于動植物體內(nèi)，不同來源的溶菌酶的結(jié)構(gòu)和生物活性各不相同，動物溶酶菌的溶菌活性遠遠低于人溶菌酶，而植物來源的溶菌酶活性更低。目前國內(nèi)主要從蛋清和蛋殼中提取制備蛋清溶菌酶，已形成規(guī)?；?，并且，由蛋清溶菌酶制成的口含片和腸溶片已進入臨床應用階段。因此，蛋清溶菌酶是近年來研究的熱點。研究表明，蛋清溶菌酶沒有明顯地直接殺滅革蘭氏陰性菌的作用，但在與抗生素聯(lián)用后，能明顯抑制LPS的釋放，進而多種細胞因子的產(chǎn)生釋放減少，從而緩解LPS 所致的炎性反應［20］。

3.6 中藥及中藥提取成分(Extracts of traditional chinese medicine and chinese medicine) 隨著中醫(yī)中藥的現(xiàn)代化發(fā)展，以及中西醫(yī)理論的結(jié)合，近五十年來，許多中藥、中藥提取的單體及復方均被證實有對抗LPS的作用，與抗菌藥等聯(lián)用在攻克重度細菌感染、膿毒癥及感染性休克等疾病的實驗研究和臨床治療方面取得了一定的成效。許峰等［21］證實丹參素等在體內(nèi)體外均能抑制LPS刺激的白細胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子，提高內(nèi)毒素攻擊小鼠的生存率。近年來，呂根法等［22］利用生物傳感技術(shù)，以類脂A為靶點，測定中草藥和Lipid A的結(jié)合能力，進而考察中草藥成分中和細菌內(nèi)毒素的效果，為篩選對抗LPS的中草藥提供了一條快捷途徑，具有準確、快速、高效、直觀等特點。常明向等［23］研制的含大黃、茵陳、梔子等的復方制劑利膽排毒口服液對內(nèi)毒素有直接破壞作用，能顯著降低感染性休克小鼠的病死率。

另外，還有其他如重組人生長激素、CMP-KDO合成酶抑制劑、人乳鐵傳遞蛋白、以及細胞因子拮抗劑等多種對抗LPS的物質(zhì)，它們在減少細菌和內(nèi)毒素易位，從而有效防止感染擴散、抑制LPS合成、阻斷LPS與其相應受體的結(jié)合，以及通過抑制細胞因子的釋放或抑制其生物活性等，可避免或減輕LPS介導的炎性反應對機體造成的損傷。

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