李保紅 崔澂 高峰 王潤(rùn)田 鄭文廣 張征崢

結(jié)直腸癌是目前世界上發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一。通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、IL-4、IL-6、IL-10、PGE2 等免疫抑制分子抑制免疫功能從而逃避免疫監(jiān)視，是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［1－3］。目前應(yīng)用于結(jié)直腸癌的放、化療藥物多具有一定的不良反應(yīng)，尤其是對(duì)免疫功能已顯低下的患者，可致全身及腫瘤局部免疫功能進(jìn)一步損傷?？沽鲋兴幹苿┚哂械投?、不對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)造成損傷的特點(diǎn)，恰可彌補(bǔ)放、化療在臨床使用中的不足［4，5］。對(duì)其影響腫瘤免疫抑制分子分泌的研究，除本課題組外筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞株 小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株Colon 26，為中國(guó)人民解放軍白求恩軍醫(yī)學(xué)院訓(xùn)練部?jī)龃妗?/p>

1.2 主要試劑及儀器 RPMI-1640為GIBCO公司產(chǎn)品，每升完全培養(yǎng)液(Complete Medium，CM)中含小牛血清0.1 L、青霉素100000 U、鏈霉素100 mg;小牛血清由河北醫(yī)科大學(xué)科技總公司提供，青霉素及鏈霉素為華北制藥集團(tuán)產(chǎn)品;MTT及DMSO 為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品。TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6、IL-10 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均為美國(guó)R＆D公司產(chǎn)品;PGE2檢測(cè)試劑盒為上海陽(yáng)光生物制品公司產(chǎn)品。Mk353型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為芬蘭ThermoLabsystems產(chǎn)品。

6種中藥制劑:亞砷酸注射液為哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20040201，10 mg/10 ml，主要成分為三氧化二砷(As2O3)。鹽酸川芎嗪(LHC)注射液為北京市永康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H 11020960，40 mg/2 ml。黃芪(AMB)注射液為成都地奧九泓制藥廠產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字Z 51021776，20 g/10 ml?？鄥⑺刈⑸湟簽樘旖蚴猩锘瘜W(xué)制藥廠產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字 H 12020506，0.2 g/2 ml，主要成分為氧化苦參堿(MOX)。豬苓多糖(PUPS)注射液為江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，ZZ-5458蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1999)第185701號(hào)，20 mg/2 ml。青蒿琥酯(ART)注射液為桂林南藥股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H 10930195，60 mg/瓶，以1 ml 5%NaHCO3溶解。所有中藥制劑實(shí)驗(yàn)前均用CM稀釋至所需濃度。

1.3 中藥制劑作用濃度的確定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Colon 26細(xì)胞加入96孔板，再分別加入系列稀釋的各種中藥制劑;使腫瘤細(xì)胞終濃度為2×108/L，6種中藥制劑的終濃度參見(jiàn)表1;設(shè)立無(wú)中藥的單純腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔(Control);一式三復(fù)孔，混勻后置37℃ 5%CO2飽和濕度中培養(yǎng)48 h，MTT法檢測(cè)A492值。選取對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)影響的中藥制劑最高濃度作為實(shí)驗(yàn)用濃度。

表1 實(shí)驗(yàn)中6種抗瘤中藥制劑的系列稀釋濃度

1.4 中藥制劑作用及作用后傳代的Colon 26再培養(yǎng)上清的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Colon 26細(xì)胞，分別用含和不含確定濃度的不同中藥制劑的CM懸至2×108/L，培養(yǎng)48 h后離心棄上清，收集的細(xì)胞洗滌后，以CM重懸至初始濃度(2×108/L)，培養(yǎng)48 h;離心收集的上清即分別為藥物作用后的Colon 26第一次再培養(yǎng)上清(As-S1、LHC-S1、AMB-S1、MOX-S1、PUPS-S1、ARTS1)和未經(jīng)藥物作用同步培養(yǎng)的相應(yīng)對(duì)照上清(Control-S1)。細(xì)胞再以CM重懸至初始濃度，再培養(yǎng)48 h;離心收集的上清即分別為藥物作用后的Colon 26第2次再培養(yǎng)上清(As-S2、LHC-S2、AMB-S2、MOX-S2、PUPS-S2、ART-S2)和未經(jīng)藥物作用同步培養(yǎng)的相應(yīng)對(duì)照上清(Control-S2)。細(xì)胞均用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示無(wú)差異。

1.5 Colon 26再培養(yǎng)上清中6種免疫抑制分子含量的檢測(cè)TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6、IL-10、PGE2 定量檢測(cè)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，最后以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定A 492值;分別以系列稀釋的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品所檢測(cè)的A 492值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值進(jìn)行直線回歸分析，根據(jù)直線回歸方程得出各種待測(cè)上清中6種免疫抑制分子的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行方差分析齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行成組設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t或t’檢驗(yàn)、單因素相關(guān)分析;采用F檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，q檢驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)用中藥制劑濃度的確定 與對(duì)照組比較，As2O3、LHC、AMB、MOX、PUPS和ART分別作用于終濃度為2×108/L的Colon 26細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)A492值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P ＞ 0.05)的最高濃度分別為 0.5 mg/L、6 mg/L、250 g/L、0.3 g/L、125 mg/L、6.25 mg/L，即對(duì) Colon 26 細(xì)胞無(wú)直接毒性作用的中藥制劑最高濃度，確定為實(shí)驗(yàn)用濃度。分別經(jīng)確定濃度的不同中藥制劑作用48 h及作用后連續(xù)2次48 h再培養(yǎng)的Colon 26細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度的抗瘤中藥制劑對(duì)Colon 26增殖的影響n=10，

表2 不同濃度的抗瘤中藥制劑對(duì)Colon 26增殖的影響n=10，

注:與對(duì)照組 (1.084 ±0.111)比較，*P ＜0.05

中藥制劑7個(gè)系列的稀釋濃度1234567 As2O3(mg/L) 0.440 ±0.050* 0.518 ±0.068* 0.790 ±0.105* 0.840 ±0.068* 0.920 ±0.073*1.059 ±0.080 1.052 ±0.093 LHC(mg/L) 0.073 ±0.013* 0.675 ±0.060* 0.833 ±0.075* 0.919 ±0.083* 0.949 ±0.100* 1.063 ±0.092 1.055 ±0.105 AMB(g/L) 0.337 ±0.033* 0.793 ±0.129* 1.030 ±0.076 1.014 ±0.081 1.015 ±0.076 1.025 ±0.074 1.056 ±0.067 MOX(g/L) 0.078 ±0.009* 0.317 ±0.051* 0.521 ±0.061* 0.804 ±0.059* 0.895 ±0.068* 1.034 ±0.067 1.027 ±0.068 PUPS(mg/L) 0.765 ±0.066* 0.931 ±0.082* 0.952 ±0.097* 0.998 ±0.089* 1.017 ±0.094* 1.065 ±0.091 1.095 ±0.115 ART(mg/L) 0.218 ±0.040* 0.607 ±0.064* 0.890 ±0.099* 0.976 ±0.088* 1.031 ±0.098*1.060 ±0.094 1.084 ±0.108

2.2 中藥制劑影響Colon 26免疫抑制分子分泌的比較分析6種中藥制劑對(duì) TGF-β1的影響有差別(F=425.699，P=0.000)，As2O3、MOX及ART作用后初始下調(diào)幅度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(下調(diào)約25%，P均＞0.05)，LHC、AMB及PUPS作用后初始下調(diào)幅度有顯著差異(分別下調(diào)約45%、50%和33%，均P=0.000);AMB的初始及持續(xù)下調(diào)幅度、維持時(shí)間均最顯著，下調(diào)作用最強(qiáng)。對(duì)IL-6的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.852，P=0.000)，AMB、MOX、PUPS 及 ART 作用后對(duì) IL-6的分泌無(wú)影響或發(fā)揮上調(diào)作用;As2O3、LHC的下調(diào)幅度均約5%，但作用時(shí)相不同。對(duì)IL-10的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.587，P=0.023)，除 PUPS 作用后可使 IL-10 上調(diào)約 2%外，其他5種中藥制劑均可下調(diào)約5%左右;As2O3的初始及持續(xù)下調(diào)幅度、維持時(shí)間均最顯著，下調(diào)作用最強(qiáng)。對(duì)PGE2的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.587，P=0.063)，除 As2O3可延遲出現(xiàn)下調(diào)外，其他5種中藥制劑均顯示上調(diào)作用。對(duì)VEGF及IL-4的影響之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為F=0.598，P=0.727;F=2.559，P=0.069)。見(jiàn)表3。

表3 中藥制劑作用后Colon 26再培養(yǎng)上清中免疫抑制分子的含量變化n=3，pg/ml，

表3 中藥制劑作用后Colon 26再培養(yǎng)上清中免疫抑制分子的含量變化n=3，pg/ml，

注:與 Control-S1 比較，*P ＜0.05;分別與 As-S1、LHC-S1、AMB-S1、MOX-S1、PUPS-S1、ART-S1 比較，#P ＜0.05;與 Control-S2 比較，△P ＜0.05

VEGF IL-4 IL-6 IL-10 PGE2 Control-S1 1295 ±30 29.18 ±1.90 27.70 ±0.70 26上清組別 TGF-β1.55 ±0.60 29.52 ±2.50 9.69 ±0.42 Control-S2 1266 ±20 29.30 ±1.80 27.65 ±1.70 26.63 ±1.00 29.63 ±1.90 9.71 ±0.44 As-S1 996 ±17* 28.25 ±0.14 27.01 ±0.13* 26.22 ±0.18 27.35 ±0.11* 26.33 ±0.25*As-S2 1026 ±19#△ 30.16 ±0.17 27.54 ±0.10# 25.56 ±0.09#△ 27.70 ±0.23△ 8.91 ±0.20#△LHC-S1 725 ±6* 28.56 ±2.11 28.12 ±0.22 25.24 ±0.78* 28.23 ±0.45* 27.04 ±0.66*LHC-S2 984 ±8#△ 29.23 ±0.86 27.47 ±0.56 26.58 ±0.34# 27.49 ±0.42#△ 25.78 ±0.25#△AMB-S1 640 ±5* 29.70 ±0.86 27.73 ±0.58 28.69 ±0.37* 27.99 ±0.61* 24.88 ±0.16*AMB-S2 561 ±5#△ 30.59 ±1.09 28.47 ±0.52 27.03 ±0.46# 29.68 ±0.30# 19.37 ±0.11#△MOX-S1 988 ±36* 29.31 ±2.04 28.54 ±0.52 26.38 ±0.59 28.21 ±0.64* 21.48 ±0.20*MOX-S2 627 ±6#△ 33.48 ±1.43#△ 29.46 ±0.63 26.49 ±0.37 28.13 ±0.51△ 12.19 ±0.18#△PUPS-S1 870 ±5* 28.09 ±1.27 27.90 ±0.14 26.81 ±0.66 30.04 ±0.45 28.06 ±0.32*PUPS-S2 949 ±8#△ 30.48 ±0.67#△ 29.98 ±0.34#△ 29.65 ±0.40#△ 31.85 ±0.88#△ 17.47 ±0.14#△ART-S1 988 ±7* 27.94 ±0.27 27.11 ±0.20 27.96 ±0.23 27.67 ±0.24* 30.72 ±0.74*ART-S2 668 ±6#△ 30.05 ±0.23 29.34 ±0.21#△ 28.79 ±0.19#△ 28.03 ±0.21△ 19.98 ±0.43#△

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，2×105/ml Colon 26分別經(jīng)確定濃度的6種中藥制劑作用48 h，及作用后徹底洗去中藥制劑再行48 h傳代培養(yǎng)，其活細(xì)胞計(jì)數(shù)與未經(jīng)中藥制劑作用同步對(duì)照培養(yǎng)的Colon 26差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明中藥制劑作用后Colon 26細(xì)胞再培養(yǎng)上清中免疫抑制分子含量的變化，確系由中藥制劑影響了Colon 26免疫抑制分子的分泌，而非改變腫瘤細(xì)胞的增殖存活狀態(tài)所致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Colon 26腫瘤細(xì)胞可分泌所測(cè)的6種免疫抑制分子，其中TGF-β1含量最高，可達(dá)(1295±30)pg/ml;6種中藥制劑作用后，可分別調(diào)變免疫抑制分子分泌，并呈現(xiàn)差異性、多效性和重疊性。不同類別中藥制劑影響分泌的種類、程度、出現(xiàn)及維持時(shí)間迥異，提示可能由于其有效成分及藥理作用特點(diǎn)的差異，導(dǎo)致對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌免疫抑制分子的影響具各自不同的譜系特征;不同中藥制劑對(duì)同一免疫抑制分子分泌的影響程度相同，可能是由于不同中藥制劑的有效成分所發(fā)揮的效應(yīng)相似所致。因此，下調(diào)腫瘤細(xì)胞免疫抑制分子的分泌，也應(yīng)是中藥制劑發(fā)揮抗瘤效應(yīng)的機(jī)制之一。

目前已知的腫瘤免疫抑制分子中，TGF-β1的免疫抑制作用最強(qiáng)，受抑制的免疫細(xì)胞種類較廣，且多種惡性腫瘤組織中TGF-β1蛋白及其mRNA表達(dá)異常增高，與腫瘤的分化、浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分級(jí)等有關(guān)，同時(shí)還與患者的短生存期及不良預(yù)后密切相關(guān)，直接影響臨床抗瘤療效［6－10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在發(fā)生下調(diào)的免疫抑制分子中，以TGF-β1基礎(chǔ)含量最高，降低幅度最大，下調(diào)幅度最高可達(dá)55.75%，且發(fā)揮下調(diào)效應(yīng)的中藥制劑種類最多，AMB、MOX、As2O3等對(duì)Colon 26腫瘤細(xì)胞分泌TGF-β1均具有強(qiáng)而持久的阻抑作用;而其他免疫抑制分子的基礎(chǔ)含量偏低，降低幅度均較小，下調(diào)幅度最高僅7.35%，且針對(duì)其發(fā)揮下調(diào)效應(yīng)的中藥制劑種類多少不一。因此推測(cè)，TGF-β1是結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的優(yōu)勢(shì)免疫抑制分子，是各種中藥制劑下調(diào)免疫抑制的重要靶分子;其它免疫抑制分子含量雖然也發(fā)生了變化，但可能并未發(fā)揮主導(dǎo)作用。

針對(duì)中醫(yī)有關(guān)熱毒內(nèi)蘊(yùn)、氣滯血瘀、痰濕凝聚、正氣虛弱的腫瘤病機(jī)，抗瘤中藥制劑可分別通過(guò)以毒攻毒、清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、化痰祛濕、扶正祛邪等作用發(fā)揮效應(yīng)。本文所選用的6種抗瘤中藥制劑，As2O3屬以毒攻毒類、MOX及ART屬清熱解毒類、LHC屬活血化瘀類、PUPS屬軟堅(jiān)散結(jié)及化痰祛濕類、AMB屬扶正祛邪類。中醫(yī)理論講究辨證施治，即在全面分析病情及患者整體免疫狀況的基礎(chǔ)上，提倡多靶點(diǎn)聯(lián)合用藥、組合性個(gè)體化方案設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMB對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌TGF-β1的下調(diào)作用最強(qiáng)，As2O3對(duì)其他5種免疫抑制分子分泌的下調(diào)效應(yīng)較顯著;提示，臨床可考慮聯(lián)合使用扶正祛邪類(例如黃芪制劑)及以毒攻毒類(例如砷制劑)抗瘤藥物組方，或許可較全面地調(diào)整患者不利于臨床治療的免疫抑制分子分泌狀態(tài)。

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