劉平，李宗軍,2*，許愛清,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)中心功能食品分中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南科技大學 生命科學學院，湖南 湘潭 411201)

茯磚是一種磚形蒸壓黑茶。目前，對茯磚茶功能的研究主要集中在減肥、降血脂方面[1]，而關(guān)于其對免疫系統(tǒng)影響的研究較少。筆者以細菌感染小鼠為模型，研究茯磚茶水提物對模型小鼠免疫功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試動物

昆明種SPF小鼠190只，雌、雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號碼為SCXX(湘)2009–0004。鼠顆粒飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。供試小鼠均飼喂在湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學院標準動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始試驗。

1.1.2 茯磚茶水提物

金湘益茯磚茶由湖南益陽茶廠提供。取 100 g茯磚茶敲碎，浸泡于400 mL蒸餾水中，攪拌，煮沸15 min，靜置冷卻1 h，過濾后定容至100 mL，制成高劑量茶汁(1 g/mL)，再分別用無菌生理鹽水稀釋至中劑量(0.5 g/mL)、低劑量 (0.05 g/mL)茶汁，備用。

1.1.3 攻毒菌液

Escherichia coli O157:H7(21530)菌種購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心?；罨蠼臃N 2 mL菌懸液到100 mL液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)好的菌液離心，用無菌生理鹽水洗滌3次，收集菌體，加適量無菌生理鹽水，據(jù)預(yù)試驗結(jié)果以O(shè)D600nm1.0的菌液作為攻毒菌液。

1.1.4 主要試劑

主要試劑：E. coli O157:H7檢測試劑盒；綿羊血；印度墨汁；兔抗小鼠CD4和CD8單克隆抗體(Epitomics)；Envision二步法通用型抗小鼠免疫組化試劑盒和DAB顯色劑試劑盒(Novocastra)。

1.2 方 法

將190只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分成5組：對照組(A組)、模型組(B組)、低劑量茶汁組(1 g/(kg·d)，C 組)、中劑量茶汁組(10 g/(kg·d)，D 組)、高劑量茶汁組(20 g/(kg·d)，E組)。以體質(zhì)量60 kg的成人日消耗茯磚茶不超過8 g的推薦量計算，C、D、E組的劑量分別相當于人類推薦量的1、10、20倍。分別給低、中、高劑量組小鼠灌胃相應(yīng)劑量茶汁3 d后，將此3組和模型組小鼠灌胃E. coli O157:H7菌液造模，造模方法參照文獻[2]，并根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選取能使小鼠感染E. coli O157:H7但不致死的劑量為攻毒菌液。攻毒途徑為經(jīng)口灌胃。每只小鼠灌胃OD600nm為1.0的菌液0.4 mL。攻毒后3 h于無菌條件下取各組小鼠糞便標本，用E. coli O157試劑盒檢測糞便中的E. coli O157。模型復(fù)制后，每天定時一次性給低、中、高劑量組小鼠灌胃相應(yīng)劑量茶汁，給模型組灌胃生理鹽水，灌胃量均為每只小鼠0.4 mL。對照組不做任何處理。試驗期間各組小鼠自由飲水和采食，連續(xù)10 d后處死。

1.2.1 測定指標及方法

1) 非特異性免疫功能指標的測定。免疫器官指數(shù)測定：于每組各取 10只小鼠，用頸椎脫臼的方法將其處死后解剖，摘取脾臟和胸腺，稱重，計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)=免疫器官質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

單核–巨噬細胞吞噬功能[3]檢測：于每組各取10只小鼠，稱重，按小鼠體質(zhì)量的0.1 mL/(10 g)劑量從尾靜脈注入稀釋 3～4倍的印度墨汁。分別于2、10 min(分別記為t1，t2)后從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，測定光密度值OD600nm(分別記為D1，D2)。將采血后小鼠處死，分別稱其肝質(zhì)量和脾質(zhì)量，計算廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)。

吞噬系數(shù)=(體質(zhì)量/肝脾總質(zhì)量)×廓清指數(shù)1/3。2)體液免疫功能檢測。血清溶血素測定[3]：取綿羊血離心后，得壓積綿羊紅細胞(SRBC)，并配成2%的細胞懸液。造模后6 d，于各組隨機選10只小鼠，在每只小鼠的腹腔注射0.2 mL SRBC懸液進行免疫。4 d后摘除小鼠的眼球，采血。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝試驗板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%的SRBC懸液，混勻，于37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。

3) 腸道局部免疫功能檢測。用免疫組化方法顯示腸黏膜上CD4+T細胞和CD8+T細胞抗原分子的表達并計數(shù)。于各組各取 10只小鼠處死后，將其十二指腸、回腸、結(jié)腸組織固定于10%的甲醛溶液中，脫水，用常規(guī)石蠟包埋、切片，脫蠟至水。將切片置于0.3%H2O2液中15 min。加入相應(yīng)一抗于濕盒中4 ℃過夜。滴加二抗，室溫孵育1 h，用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗，用相同方法做對照試驗。在光學顯微鏡下，在每只小鼠的十二指腸、回腸、結(jié)腸各取4個區(qū)域，統(tǒng)計 4個高倍鏡視野下腸黏膜上 CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003和SPSS 11.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的臨床表現(xiàn)

試驗期間，A 組(對照組)小鼠活潑好動，毛色正常，抓尾反抗力強，無明顯臨床癥狀； B～E組小鼠都存在毛發(fā)蓬松、活動減少、抓尾反抗力弱等現(xiàn)象。經(jīng)檢測，B～E組小鼠糞便的E. coli O157:H7陽性率為 100%，A組小鼠均為陰性，表明造模成功。在攻毒3 d后，C～E組小鼠的臨床癥狀有不同程度改善，小鼠毛色漸趨正常，活動增多，抓尾反抗力增強。

2.2 小鼠的免疫器官指數(shù)和碳廓清試驗結(jié)果

由表1可見，茶汁中、高劑量組胸腺指數(shù)均顯著高于模型組(P＜0.05)，且中劑量組與模型組差異極顯著(P＜0.01)。脾指數(shù)各組差異不顯著。

表1 各組小鼠的免疫器官指數(shù)Table1 Immune organ indexes of in mice

碳廓清試驗結(jié)果顯示，模型組、對照組的吞噬系數(shù)分別為3.93、5.07，二者差異極顯著(P＜0.01)；茶汁低劑量組吞噬系數(shù)為4.92，與模型組差異顯著(P＜0.05)，中、高劑量組吞噬系數(shù)分別為5.31、5.27，均與模型組差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 小鼠的血清溶血素試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，模型組、對照組小鼠的血清溶血素抗體積數(shù)分別為 37.2、44.6，二者差異顯著(P＜0.05)；茶汁中劑量組血清溶血素抗體積數(shù)為45.5，顯著高于模型組(P＜0.05)；高劑量組血清溶血素抗體積數(shù)為46.7，極顯著高于模型組(P＜0.01)。

2.4 小鼠腸道黏膜上CD4+T和CD8+T細胞的表達

免疫組織化學法顯示，在小鼠的十二指腸、回腸、結(jié)腸均有CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的表達。CD4+T淋巴細胞主要位于腸黏膜固有層，上皮內(nèi)也有少量。CD8+T淋巴細胞主要位于腸黏膜上皮細胞基底層，在腸黏膜固有層也有表達。模型組CD4+T和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量顯著低于對照組(P＜0.05)。茶汁中、高劑量組的細胞數(shù)目顯著高于模型組(P＜0.05)。

表2 各組小鼠的CD4+T和CD8+T淋巴細胞Table 2 CD4+ and CD8+ T-lymphocytes in mice

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：茯磚茶能提高小鼠的免疫功能，且呈一定的量效關(guān)系，中、高劑量比低劑量效果明顯。本試驗中成功復(fù)制了E. coli O157:H7感染的模型，被感染的模型組小鼠的非特異免疫、體液免疫和腸道局部免疫功能均比對照組低。灌服中、高劑量茯磚茶水提物能直接刺激模型小鼠胸腺的發(fā)育，提高其中樞免疫器官的質(zhì)量；促進B細胞產(chǎn)生抗體，提高其體液的免疫功能；增加腸道局部CD4+T和CD8+T淋巴細胞數(shù)目，提高T淋巴細胞的活性，增強細胞的免疫功能；灌服低、中、高劑量的茯磚茶水提物均能提高單核-巨噬細胞的吞噬功能，增強小鼠的非特異性免疫功能。

推測茯磚茶水提物是通過多環(huán)節(jié)、多靶點影響免疫系統(tǒng)的。這可能是茯磚茶防治E.coli O157：H7感染的機制之一。茶葉中的功能性成分如茶氨酸、茶多糖和茶多酚等已被證實在調(diào)節(jié)免疫方面有重要作用[4–8]。茯磚茶中的茶多糖、茶多酚含量較高，這些活性物質(zhì)有增強免疫功能的作用。在茯磚茶獨有“發(fā)花”工序中產(chǎn)生的優(yōu)勢菌——冠突散囊菌，目前已被證實在降脂、減肥及抗腫瘤等方面有特殊作用，而其對免疫方面的影響尚未見報道，故茯磚茶中哪些活性成分具有提高免疫的作用有待研究。

[1]傅冬和，劉仲華，黃建安.茶葉降脂減肥作用研究進展[J].中國茶葉，2004(2)：8–10.

[2]倪曉平，孫建榮，查捷，等.大腸桿菌O157:H7對小鼠感染的實驗研究[J].中國人獸共患病雜志，2002，18(3)：74–76.

[3]劉少勇.靈芝孢子油軟膠囊對小鼠免疫功能的影響及毒理學研究[D].廣州：暨南大學，2007.

[4]陳睿.茶葉功能性成分的化學組成及應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2004，32(5)：1031–1033，1036.

[5]Kamath A B，Wang I，Das H，et al.Antigens in tea–beverage prime human Vγ2Vδ2T cells in vitro and in vivo for memory and non-memory antibacterial cytokine responses[J].PNAS，2003，100(10)：6609–6614.

[6]沈健，陳增良，鮑建芳，等.茶多糖對實驗性免疫力低下小鼠免疫功能的影響[J].浙江預(yù)防醫(yī)學，2007，19(4)：96–97.

[7]楊敏，趙文華，王書奉，等.粗老茶中的茶多糖對免疫功能的影響[J].時珍國藥研究，1997，8(4)：22–23.

[8]陳宗懋.茶的殺菌和抗病毒功效[J].中國茶葉，2009(9)：4–5.