吳丹，李琰，胡寶慶，文春根

（南昌大學 生物科學系，江西 南昌 330031）

活性氧（ROS）是需氧生物生命活動中的代謝產(chǎn)物及其衍生的氧自由基，在生物體內(nèi)參與能量的產(chǎn)生、細胞的吞噬、細胞生長的調(diào)節(jié)和細胞內(nèi)信號的傳導，以及一些重要生物復(fù)合物的合成[1]。自由基過多會引起 DNA 損傷、酶失活、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化損傷，從而導致生物體的生理病變[2]。在正常機體內(nèi)，ROS會被抗氧化系統(tǒng)的酶降解，以維持機體的健康狀態(tài)，即超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化因子調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS的水平，以適應(yīng)外界環(huán)境，保護機體免受損傷[3-4]。貝類受到外源異物刺激后，其血細胞會產(chǎn)生典型的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象，同時產(chǎn)生具有殺菌作用的ROS[5]。貝類血細胞通過吞噬和包囊作用來清除細胞內(nèi)病原體和胞外寄生蟲[6-7]。這一過程被認為是吞噬細胞的氧依賴性殺菌途徑之一[8-9]。大量產(chǎn)生的ROS會引起貝類體內(nèi)各種抗氧化酶活力的變化。外源微生物或其他刺激物對貝類抗氧化系統(tǒng)的影響已有相關(guān)研究[10-11]，且主要是關(guān)于對海洋貝類的研究，對淡水貝類的研究尚少。

褶紋冠蚌 （Cristaria plicata） 是中國主要淡水育珠蚌之一，具有較高的經(jīng)濟價值。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila） 是水環(huán)境中的條件致病菌，可以引起貝類等水生動物組織或器官病變，也能影響抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶的活性[12]。筆者用嗜水氣單胞菌感染褶紋冠蚌，研究感染后褶紋冠蚌抗氧化因子的變化，以期為淡水貝類非特異免疫功能的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

嗜水氣單胞菌菌種由中國科學院水生生物研究所提供，由南昌大學水產(chǎn)動物寄生蟲與免疫學研究室保種。褶紋冠蚌采自鄱陽湖。測定超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GPX）、谷胱甘肽 （GSH）、過氧化氫 （H2O2） 及丙二醛 （MDA）的試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，其產(chǎn)品批號均為20100601。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

選擇殼長（9.66±1.07） cm、殼高（6.58±0.85） cm的健康蚌，在水族箱中連續(xù)充氣暫養(yǎng)1周，每天換水1次，水溫保持（25±1） ℃。

將保存的嗜水氣單胞菌接入胰蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基（TSB），30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600nm為 0.6 左右，于4 ℃ 冰箱中保存，備用。選取健康的褶紋冠蚌 40 只，隨機分成 2 組，分別用微量注射器從試驗組每只蚌后閉殼肌注射濃度為 109個細胞/mL的嗜水氣單胞菌菌液0.1 mL，對照組注射等量的無菌生理鹽水。

1.2.2 血清樣品和肝胰腺提取液的制備

注射嗜水氣單胞菌后，分別在注射后3、6、12、24、48 h 用注射器從試驗組和對照組各蚌的閉殼肌血竇中取血[13]，每個時段各取 4 只蚌，每只蚌取血10 mL，分別裝入10 mL的離心管，然后分別以4 ℃，3 600 r/min離心10 min，移出上清液，獲得試驗所用血清樣品，置于4 ℃冰箱中保存。

取血后，每只蚌取出適量肝胰腺，濾紙吸干水分后稱重，加入無菌生理鹽水，使組織勻漿液的質(zhì)量濃度達到0.1 g/mL，于冰浴中勻漿后，以4 ℃、3 000 r/min離心10 min，其上清液即為肝胰腺組織提取液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 血清和肝胰腺抗氧化指標的測定

SOD 活性測定采用羥胺法。血清中SOD活性為每1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量，單位為U/mL；組織勻漿中SOD活性為每1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量，單位為U/mg。GPX活性測定采用2-硫代2-硝基苯甲酸間接法。因GPX可以促進H2O2與GSH反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），因此，GPX的活力以催化GSH的反應(yīng)速率來表示，即用單位時間內(nèi)GSH減少的量來表示。在GPX催化下，GSH和DTNB作用生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，測定該離子的濃度，即可計算出GSH減少的量。組織中GPX活性用扣除非酶反應(yīng)作用后，每1 mg蛋白質(zhì)每1 min反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L時GPX的量表示。由于GSH在沒有酶的條件下也能進行氧化反應(yīng) （非酶反應(yīng)），所以，最后計算酶活性時，必須扣除非酶反應(yīng)引起的GSH的減少量。組織中GPX活性為扣除非酶反應(yīng)作用后，反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L時GPX的量；血清中GPX活性為每 0.1 mL血清在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用后，反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L時GPX的量。MDA含量的測定采用TBA法?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量用考馬斯亮藍法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。利用方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌感染對褶紋冠蚌血清和肝胰腺中SOD活性的影響

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，褶紋冠蚌血清和肝胰腺中的SOD活性均先降低后升高再降低 （表1，表2）。感染后3 h，血清和肝胰腺中SOD的活性均最高。血清中SOD的活性在 6 h 時最低，12～24 h變化不大 （表1）；肝胰腺中SOD的活性在6～12 h逐漸降低，24 h時略有升高，然后逐漸降低，48 h時最低（表2）。對照組血清中SOD活性先升高后降低，在12 h時最高；肝胰腺中SOD活性先升高后降低，12 h時最高。t檢驗結(jié)果顯示：試驗組與對照組中血清SOD活性在3 h時有顯著差異（P＜0.05），肝胰腺中SOD活性各時段均無顯著差異。

表1 嗜水氣單胞菌感染后褶紋冠蚌血清中的抗氧化因子Table 1 Antioxidant factors in blood serum from Cristaria plicata infected with Aeromonas hydrophila

表2 嗜水氣單胞菌感染后褶紋冠蚌肝胰腺中的抗氧化因子Table 2 Antioxidant factors in hepatopancreas from Cristaria plicata infected with Aeromonas hydrophila

2.2 嗜水氣單胞菌感染對褶紋冠蚌血清和肝胰腺中GPX活性的影響

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，血清中GPX的活性3 h后開始緩慢下降，至6 h后又逐步上升，到12 h時最高，然后緩慢下降，48 h時基本恢復(fù)（表1）。肝胰腺中GPX的活性先升高，6 h后開始下降，到12 h降至最低，然后再上升，升至24 h后再下降，48 h后降至最低水平（表2）。對照組血清中GPX的活性緩慢下降，48 h降至最低。對照組肝胰腺中 GPX活性先逐步升高，在24 h時最高，然后下降。t檢驗結(jié)果顯示：試驗組與對照組血清中 GPX的活性在12、24和48 h時均有顯著差異（P＜0.05），肝胰腺中GPX的活性沒有顯著差異。

2.3 嗜水氣單胞菌感染對褶紋冠蚌血清和肝胰腺中GSH含量的影響

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，褶紋冠蚌血清中GSH的含量在3～48 h呈下降趨勢（表1）；肝胰腺中GSH的含量在3～6 h升高，6 h后持續(xù)下降，48 h降至最低（表2）。對照組血清中GSH的含量先降低后升高，6 h時最低，24 h時最高；肝胰腺中GSH的含量先升高后降低，再升高至24 h的最高后降低。t檢驗結(jié)果顯示：試驗組與對照組血清中GSH的含量在24 h和48 h時有顯著差異（P＜0.05，表1）；肝胰腺中GSH的含量在24 h時有顯著差異（P＜0.05，表2）。

2.4 嗜水氣單胞菌感染對褶紋冠蚌血清和肝胰腺中MDA含量的影響

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，褶紋冠蚌血清中MDA的含量變化很大，3 h后迅速降低，24 h時恢復(fù)到正常水平（表1）；肝胰腺中MDA含量在3～6 h基本無變化，6 h后持續(xù)下降，至24 h降至最低，然后開始恢復(fù)，至48 h恢復(fù)到初始水平（表2）。對照組血清中MDA含量在6～24 h基本無變化；肝胰腺中MDA含量在3～24 h下降明顯，24 h時最低點，24 h后有所升高。t檢驗結(jié)果顯示：試驗組與對照組血清中MDA含量在6 h和12 h時差異極顯著（P＜0.01）。

2.5 嗜水氣單胞菌感染對褶紋冠蚌血清和肝胰腺中H2O2含量的影響

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，血清中 H2O2的含量與對照組血清中 H2O2的含量變化趨勢基本一致，均在12 h時最高，之后平緩下降（表1）。t檢驗結(jié)果顯示：試驗組與對照組血清中 H2O2含量均無顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，肝胰腺中H2O2的含量在12 h時最高，在12～48 h變化不大（表2）。對照組肝胰腺中H2O2的含量在3～48 h變化不明顯。t檢驗結(jié)果顯示：試驗組與對照組肝胰腺中H2O2含量無顯著差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

褶紋冠蚌經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，由SOD、GPX活性及GSH、H2O2、MDA含量的變化可以看出，感染后的褶紋冠蚌由于呼吸爆發(fā)產(chǎn)生了更多的ROS。SOD和GPX活性增加，GSH含量隨試驗時間的延長而降低，這說明在一定程度上嗜水氣單胞菌能誘導SOD和GPX的活性，清除活性氧自由基，但MDA含量的變化表明嗜水氣單胞菌對褶紋冠蚌造成了氧化損傷。

適當?shù)拇碳е峦淌杉毎?jīng)歷呼吸爆發(fā)并產(chǎn)生大量的細胞毒氧化劑，即胞毒活性氧[14]。在絕大多數(shù)雙殼或腹足貝類中都發(fā)現(xiàn)了伴隨吞噬的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象[5]。呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的ROS可以對細菌等外來異物進行殺滅，在抗菌、抗病中起著關(guān)鍵作用。不同外源物刺激貝類所產(chǎn)生的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象存在差別。用海洋酵母細胞和酵母聚糖刺激皺紋盤鮑，其血細胞在吞噬活動中明顯地產(chǎn)生呼吸爆發(fā)現(xiàn)象和活性氧[15]。褶紋冠蚌經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，血清和肝胰腺中過氧化氫的含量均稍高于對照組，且肝胰腺中的過氧化氫含量比血清中的高得多，這表明感染后的褶紋冠蚌由于呼吸爆發(fā)產(chǎn)生了更多的ROS。肝胰腺中過氧化氫含量比血清高，可能是由于肝胰腺的抗氧化能力高于血清。肝胰腺抗氧化酶種類和數(shù)量較多，抗氧化物質(zhì)較為豐富，尤其是肝胰腺中 SOD等過氧化物酶的含量較高，所以，其清除活性氧的能力較強，且 SOD歧化超氧陰離子時也會產(chǎn)生過氧化氫[16-17]。

雖然呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的活性氧具有殺菌作用，但ROS對貝類本身也有毒害作用，必須及時清除[18]。SOD、CAT、GPX等抗氧化酶可以清除活性氧自由基，維持正常生理活動。背角無齒蚌經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，其血清和肝胰腺SOD活性均是先升高后降低，12 h時達到最高點；肝胰腺SOD活性在12～48 h下降平緩[19]。SOD活性的升高，意味著有大量超氧陰離子氧化自由基產(chǎn)生，表明生物有機體抗氧化性和免疫能力增強。褶紋冠蚌經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，其血清和肝胰腺SOD的活性都在短時間內(nèi)顯著升高，說明嗜水氣單胞菌能在短時間內(nèi)提高SOD活性，清除體內(nèi)多余的活性氧自由基，在體內(nèi)自由基達到平衡時，SOD的活性恢復(fù)到正常水平。

GPX是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，它可以消除機體內(nèi)的過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物，使細胞膜和其他生物組織免受過氧化損傷[20]。褶紋冠蚌經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，開始時血清中 GPX活性比對照組的稍低，這可能是由于嗜水氣單胞菌在短時間內(nèi)還未能激活血清中GPX的活性；6 h后血清中GPX的活性比對照組的高，肝胰腺中GPX的活性在3～48 h都比對照組的高，這表明肝胰腺的GPX對嗜水氣單胞菌的刺激反應(yīng)較快，而血清中的GPX對菌的刺激反應(yīng)遲緩。

GSH是抗氧化系統(tǒng)中重要的一類清除活性氧自由基的小分子物質(zhì)。當機體受到外源化學物的攻擊時，GSH與外源化學物結(jié)合的功能及抗氧化功能在保持細胞和細胞器膜結(jié)構(gòu)的完整性和肝臟解毒方面起著非常重要的作用[21]。用 10 μg/L MC-LR處理鯉肝細胞，6 h后GSH含量明顯下降，而對照組GSH只略微下降，表明GSH參與了防御MC-LR造成的氧化損害[22]。經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，褶紋冠蚌血清中GSH的含量一直呈下降趨勢，表明GSH參與了對活性氧的清除；肝胰臟中 GSH含量的變化，可能是肝胰腺的 ROS對嗜水氣單胞菌的刺激處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，當SOD、GPX等抗氧化酶活性還未起作用時，GSH含量升高，而抗氧化酶活性升高時會消耗GSH，從而使其含量下降。

MDA含量的變化可反映機體受氧化損傷的程度。用高濃度的 Ce（NO3）3處理蚌[0]3 d時，肝臟MDA含量顯著降低，飼養(yǎng)15 d后，MDA含量均顯著高于對照組，說明Ce（NO3）3超過一定濃度可誘發(fā)機體脂質(zhì)過氧化，也表明Ce對三角帆蚌機體產(chǎn)生影響的原因之一是隨著體內(nèi)Ce含量的增加，體內(nèi)自由基積累，加劇了膜脂過氧化，使膜的結(jié)構(gòu)和功能遭受破壞，進而引起一系列代謝紊亂，最終對三角帆蚌造成毒害[23]。經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后，褶紋冠蚌肝胰腺中 MDA含量略高于對照組，血清中MDA含量在3～24 h明顯高于對照組，這表明嗜水氣單胞菌對機體造成了一定程度的氧化損傷，也可能是因為機體受嗜水氣單胞菌刺激產(chǎn)生了氧化脅迫。

[1] Loughlin K R，Manson K，Cragnale D，et al．The use of hydrogen peroxide to enhance the efficacy of doxorubicin hydrochloride in a murine bladder tumor cell line[J]．J Urol，2001，165（4）：1300-1304．

[2] Jin L H，Bahn J H，Eum W S，et al．Transduction of human catalase mediated by an HIV-1 TAT protein basic domain and arginine-rich peptides into mammalian cells[J]．Free Radic Biol Med，2001，31（11）：1509-1519．

[3] Lein? S，Lehtonen K K．Seasonal variability in biomarkers in the bivalvesMytilus edulisandMacoma balthicafrom the northern Baltic sea [J]．Comparative Biochemistry and Physiology，2005，140：408-421．

[4] Soldatov A A，Gostyukhina O L，Golovina I V. Antioxidant enzyme complex of tissues of the bivalveMytilus galloprovincialisLam．under normal and oxidative-stress conditions：A review[J]．Applied Biochemistry and Microbiology，2007，43（5）：556-562．

[5] 張峰，李光友．皺紋盤鮑血細胞吞噬發(fā)光的研究[J]．海洋與湖沼，2000，31（4）：386-391．

[6] Arumugam M，Romestand B，Torreilles J，et al．In vitroproduction of superoxide and nitric oxide （as nitrite and nitrate） by Mytilus galloprovincialis haemocytes upon incubation with PMA or laminarin or during yeast phagocytosis[J]．European Journal of Cell Biology，2000，79（7）：513-519．

[7] Tafalla C，Go′mez-Leo′n J，Novoa B，et al．Nitric oxide production by carpet shell clam （Ruditapes decussates） hemocytes[J]．Developmental and Comparative Immunology，2003，27：197-205．

[8] Ortuno J，Esteban M A，Meseguer J．Kinetics of hydrogen peroxide production duringin vitrorespiratory burst of seabreamSparus aurataL．head-kidney leucocytes，as measured by a flow cytometric method[J]．Fish & Shellfish Immunol，2000，10：725-729．

[9] 馬洪明，麥康森．貝類血細胞的吞噬作用和非我識別[J]．海洋科學，2003，27（2）：16-18．

[10] 孫虎山，王宜艷，楊靜，等．病毒感染對櫛孔扇貝血淋巴中過氧化氫酶和過氧化物酶活力的影響[J]．水產(chǎn)科學，2004，23（8）：4-6．

[11] 王淑紅，王藝磊，張朝霞，等．弧菌和大腸桿菌感染對雜色鮑無細胞血淋巴中幾種酶活力的影響[J]．中國水產(chǎn)科學，2004，11（1）：37-40．

[12] 王玥，胡義波，姜乃澄．氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮對羅氏沼蝦免疫相關(guān)酶類的影響[J]．浙江大學學報：理學版，2005，32（6）：698-705．

[13] 謝彥海，胡寶慶，文春根．背角無齒蚌（Anodonta woodiana） 血細胞的分類[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2010，36（1）：61-64．

[14] Allen R C，Stjemholm R L，Steele R H．Evidence for the generation of an electronic excitation state（s） in human polymorphonuclear leukocytes and its participation in bactericidal activity[J]．Biochemical and Biophysical Research Communications，1972，47（4）：679-684．

[15] 張峰，李光友，張培軍．皺紋盤鮑血細胞活性氧產(chǎn)生的研究[J]．中國水產(chǎn)科學，1999，6（3）：37-39．

[16] 孔祥會，王桂忠，艾春香，等．鋸緣青蟹不同器官組織中總抗氧化能力和SOD活性的比較研究[J]．臺灣海峽，2003，22（4）：469-474．

[17] 譚樹華，鄧先余，蔣文明，等．高濃度鉻對克氏原螯蝦抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J]．農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26（4）：1356-1360．

[18] Pipe R K，Porte C，Livingstone D R．Antionxidant enzymes associated with the blood cells and haemolymph of the musselsMytilus edulis[J]．Fish Shellfish Immunology，1993，3：221-233．

[19] 饒玉才，胡寶慶，文春根．嗜水氣單胞菌感染對背角無齒蚌5種免疫相關(guān)酶活力的影響[J]．水生生物學報，2009，33（3）：406-412．

[20] 王詠梅．自由基與谷胱甘肽過氧化物酶[J]．解放軍藥學學報，2005，21（5）：369-371．

[21] 李雪婷，邱飛嬋，賈鳳蘭，等．雙氯滅痛對小鼠肝臟氧化應(yīng)激的誘導作用[J]．衛(wèi)生毒理學雜志，2004，18（1）：4-7．

[22] 李效宇，劉永定，宋立榮，等．鯉肝細胞抗氧化系統(tǒng)對微囊藻毒素毒性的反應(yīng)[J]．水生生物學報，2003，27（5）：272-275．

[23] 楊曉斌，金葉飛，吳波．鈰對三角帆蚌肝臟抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響[J]．水利漁業(yè)，2008，28（3）：16-18．