李仁道，何金德

(1、江西省東鄉(xiāng)縣疾病預(yù)防控制中心，江西 東鄉(xiāng) 331800；2、江西省東鄉(xiāng)縣環(huán)境監(jiān)測(cè)站，江西 東鄉(xiāng) 331800)

抗生素在人和動(dòng)物中的濫用所導(dǎo)致的微生物抗生素耐藥性在國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)和畜牧獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域一直受到高度重視，而其對(duì)生態(tài)環(huán)境所造成的負(fù)面效應(yīng)還鮮為人知。隨著抗生素的大量使用，部分沒(méi)有被代謝掉的抗生素會(huì)隨人和動(dòng)物的排泄作用而不斷進(jìn)入環(huán)境，從而使得環(huán)境中的微生物長(zhǎng)期處于低濃度抗生素的訓(xùn)化狀態(tài)中，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后也有可能逐漸產(chǎn)生耐藥性。微生物耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理之一就是耐藥基因的形成，比如抗性基粒。一旦產(chǎn)生這種基因，就有可能會(huì)引起更廣泛的傳播。歐盟各國(guó)學(xué)者最近的研究結(jié)果表明，環(huán)境中抗生素微量污染及抗生素耐藥性細(xì)菌的存在和傳播不容忽視[1，2]。

水環(huán)境中耐熱大腸菌群的抗生素耐藥性具有尤其重要的衛(wèi)生學(xué)意義：水中耐藥菌及其耐藥因子能通過(guò)飲水或游泳等途徑進(jìn)入人體腸道進(jìn)而將耐藥性轉(zhuǎn)移腸道寄居的細(xì)菌獲得性耐藥[3]。

進(jìn)入污水處理廠的污水主要是居民的生活污水，也包含有醫(yī)院排放的污水，抗生素殘留的可能性很大。本研究從江西省東鄉(xiāng)縣污水處理廠二沉池中采集水樣分離出耐熱大腸群菌，并采用藥敏試紙擴(kuò)散法選用了15種目前臨床上常用的抗生素，進(jìn)行了抗藥性的初步研究。

1 材料與方法

1.1 水樣 東鄉(xiāng)縣污水處理廠始建于2009年，是一座現(xiàn)代化城市污水集中處理廠，污水主要來(lái)自縣城區(qū)域的居民生活污水及兩家縣級(jí)醫(yī)院排放的污水。平均日處理污水2.5～3萬(wàn)m3。本研究于2011年4月采取污水處理廠的二沉池的水樣，用經(jīng)滅菌的玻璃瓶裝回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 耐熱大腸菌群的分離 耐熱大腸菌群又稱糞大腸菌群，是一類(lèi)通常寄居于人和溫血?jiǎng)游锬c道,在44.5℃生長(zhǎng)良好并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，主要包括大腸埃希桿菌(E.coli)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷菌屬(Serratia)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。在受到糞便污染的水體中，此菌群與腸道致病菌具有相似的適應(yīng)性和敏感性，存在時(shí)間大致相同，因此在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中被用作糞便污染的優(yōu)良指示菌[4]。

本實(shí)驗(yàn)參照美國(guó)《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》[5]中的濾膜法在4h內(nèi)對(duì)水樣中的耐熱大腸菌群進(jìn)行檢測(cè)分離。10ml水樣加入90ml無(wú)菌生理鹽水中充分混勻。用口徑為47mm、孔徑0.45μl的微孔濾膜過(guò)濾。濾膜細(xì)菌截留面向上，以滾動(dòng)方式置于經(jīng)改良的m-FC平板(以甲基藍(lán)替換苯胺藍(lán))上，排除光滑面與平板表面的氣泡。于37℃進(jìn)行5h復(fù)蘇培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至44.5℃培養(yǎng)19h。

對(duì)濾膜上典型藍(lán)色菌落數(shù)為20～60的平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算耐熱大腸菌群平均密度。用無(wú)菌接種針挑取各類(lèi)形態(tài)的藍(lán)色菌落50個(gè)，用LB培養(yǎng)基平板劃線接種純化，純化菌株接種于半固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時(shí)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 耐藥性測(cè)定 采用紙片擴(kuò)散法 (Kirby-Bauer法)[6]，按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[7]判斷結(jié)果。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

2.1 耐熱大腸菌群檢測(cè)結(jié)果 污水耐熱大腸菌群平均密度為為 9.2×102CFU/100ml。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 50株耐熱大腸菌群除對(duì)對(duì)亞胺培南全部敏感外，對(duì)其余14種抗生素均表現(xiàn)了不同程度的耐藥，其中對(duì)氨芐西林耐藥率最高為78%。具體耐藥情況見(jiàn)表1。

3 討論

表2 耐熱大腸菌群對(duì)常用抗生素藥物的耐藥率

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，污水環(huán)境中耐熱大腸菌群對(duì)常用抗生素存在一定程度的耐藥性。與劉小云等通過(guò)水環(huán)境中耐熱大腸菌群對(duì)10種常用抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)，表明水環(huán)境微生耐藥性普遍存在的結(jié)論基本相符[8]。

在本實(shí)驗(yàn)中，分離出的耐熱大腸菌群的耐藥率由高到低分別為氨芐西林、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、哌拉西林、阿米卡星、頭孢西丁、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、亞胺培南，其中β-內(nèi)酰胺類(lèi)(包括青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi))的氨芐西林耐藥率78%、頭孢他啶耐藥率為32%、頭孢曲松耐藥率28%、頭孢噻肟耐藥率26%、頭孢噻吩耐藥率為24%、頭孢西丁耐藥率20%、阿莫西林/克拉維酸17%。與常曉松等對(duì)醫(yī)院污水污染水環(huán)境中耐熱大腸菌群氨芐西林耐藥率80.0%、頭孢噻肟耐藥率25.0﹪實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[9]。青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的抗菌素，其在臨床的大量應(yīng)用導(dǎo)致針對(duì)此類(lèi)抗菌素的耐藥率升高，并占主導(dǎo)地位[9]。水環(huán)境中的耐熱大腸菌群對(duì)青霉素類(lèi)抗菌素產(chǎn)生這么高的耐藥率，說(shuō)明青霉素類(lèi)抗菌素的濫用已經(jīng)非常嚴(yán)重，不僅增加了臨床耐藥性傳播的機(jī)率，而且導(dǎo)致了排放水環(huán)境中相應(yīng)抗菌素耐藥率的顯著升高。水環(huán)境微生物耐藥性形成的原因可能有：人和動(dòng)物體內(nèi)耐藥菌及耐藥因子向水環(huán)境的擴(kuò)散，水環(huán)境中低濃度的抗生素對(duì)菌群產(chǎn)生的耐藥性選擇壓力[2]。雖然其機(jī)機(jī)制并未確定，但水環(huán)境微生物耐藥極有可能是公共衛(wèi)生和生態(tài)環(huán)境的一大隱患。耐藥微生物及耐藥因子可經(jīng)多途徑侵入人體，將耐藥性傳遞給體內(nèi)致病菌，加大臨床中感染性疾病的治療難度[10-12]。

耐藥性是微生物對(duì)抗菌藥物的相對(duì)抗性，是細(xì)菌等微生物受到抗生素的選擇性壓力的反應(yīng)，是微生物進(jìn)化過(guò)程的自然規(guī)律，也是微生物耐藥基因長(zhǎng)期進(jìn)化的必然結(jié)果。由于抗生藥物殺死了敏感菌群，而對(duì)耐藥菌的存活和繁殖無(wú)效，所以耐藥性是過(guò)度使用和濫用抗菌藥的必然后果。因此，人們應(yīng)該嚴(yán)格控制抗生素的預(yù)防使用和非醫(yī)療中農(nóng)、林、牧、副、漁以及飼料的抗生素使用，醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)積極加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，合理、規(guī)范選用抗菌藥物，才能控制耐藥菌株的出現(xiàn)與傳播。

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