朱名勝,朱 敬,王紹基,宋明華

斯氏貍殖吸蟲病(Pagunogonimiasis skrjabini)的病原體為斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimus skrjabini),是在中國廣泛分布,危害嚴(yán)重的食源性寄生蟲病。湖北省十堰市曾在蟹體內(nèi)查出斯氏貍殖吸蟲囊蚴,在貓、犬體內(nèi)也檢出過斯氏貍殖吸蟲成蟲[1],因當(dāng)?shù)鼐用裼酗嬌褪成返牧?xí)慣,斯氏肺吸蟲病病人時(shí)有發(fā)現(xiàn)[2]。由于人體為該蟲的非正常宿主,感染后導(dǎo)致“幼蟲移行癥”引起多組織、器官的損害,嚴(yán)重危害其身體健康[3-4],該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,常被誤診、誤治。為了探索較簡易的血清學(xué)診斷方法,作者采用肺吸蟲病金標(biāo)滲濾試劑盒(DIGFA-kit)和免疫酶染色試驗(yàn)(IEST)對流行區(qū)人群和斯氏貍殖吸蟲感染鼠血清進(jìn)行特異性抗體檢測,比較二者的敏感性和特異性。

1 材料與方法

1.1 試劑盒 肺吸蟲病抗體快速檢測(金標(biāo)滲濾法)試劑盒(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)。

1.2 血清樣本 斯氏貍殖吸蟲病流行區(qū)湖北省十堰市居民血清1 062份,感染斯氏貍殖吸蟲90d大鼠血清40份(每鼠感染囊蚴30個(gè)),感染旋毛蟲50d大鼠血清34份,感染日本血吸蟲40d家兔血清30份,蛔蟲病人血清28份,健康大鼠血清40份。其中40只實(shí)驗(yàn)大鼠感染后每周心臟穿刺取血1次,分離血清備用。

1.3 冰凍切片抗原制備 剖殺經(jīng)人工感染斯氏貍殖吸蟲 3個(gè)月的犬,從肺蟲囊中收集成蟲,用0.01mol/L pH7.4 PBS(含 0.05%Tween20)沖洗后,冰凍切片,厚度 6μ m,每張載玻片裱貼5塊抗原片,經(jīng)丙酮固定后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DIGFA 取試劑盒置一平面上,加洗脫液1滴(100μL),使加樣孔上 NC 膜濕潤;加待檢血清25μL,待滲入;加洗脫液 1 滴(100μL),洗去未結(jié)合抗體;加膠體金-羊抗人IgG標(biāo)記物1滴(100μL),待滲入;加洗脫液2滴(200μL),滲入后肉眼判斷結(jié)果。中央圓孔NC膜上出現(xiàn)了紅色圓點(diǎn)為陽性;未出現(xiàn)紅色圓點(diǎn),僅留白色或淡紅色背景為陰性。

1.4.2 IEST 將測試血清用0.01mol/L pH7.4 PBS分別作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋,分別取1滴滴于斯氏貍殖吸蟲成蟲冰凍切片上,置濕盒中35℃孵育60min,用0.01mol/L pH7.4 PBS洗滌3次,每次5min,吹干。滴加酶標(biāo)葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA,北京生物制品研究所產(chǎn)品,工作濃度1∶20),同上培育洗滌。再加底物溶液(3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽-過氧化氫),室溫反應(yīng)15～20min,棄底物,用蒸餾水速洗,將濕片置光鏡下觀察反應(yīng)。結(jié)果判定:抗原片不著色為(-);呈淡棕色為(+);棕色為(++);棕褐色為(+++)。陽性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)定為血清稀釋度≥1∶10(+)。

2 結(jié) 果

2.1 特異性 斯氏貍殖吸蟲流行區(qū)人群及斯氏貍殖吸蟲病鼠血清DIGFA和IEST的陽性檢出率均為5.08%和100%,其它對照血清除1例血吸蟲病兔DIGFA出現(xiàn)陽性反應(yīng)外,均為陰性(表1)。

2.2 敏感性 40只大鼠感染后不同時(shí)間二種方法檢測結(jié)果見表2,二種方法感染后第1周血清抗體均為陰性,從第2周開始出現(xiàn)陽性,第4周陽性率達(dá)100%,持續(xù)至第 8周。

表1 DIGFA和IEST檢測血清斯氏貍殖吸蟲抗體結(jié)果Table 1 Result of detection for antibody test of human in endemic area and animals with different parasitic diseases by DIGFA and IEST

表2 大鼠感染斯氏貍殖吸蟲后血清抗體檢測結(jié)果(DIGFA和IEST)Table 2 Results of detection for antibody in serafrombig rats infected with Pagumogonimus skrjabini

3 討 論

斯氏貍殖吸蟲是一種人獸共患寄生蟲,一般在人體內(nèi)不能發(fā)育為成蟲,病原學(xué)診斷較為困難。免疫學(xué)診斷常用的方法主要是皮內(nèi)試驗(yàn),皮內(nèi)試驗(yàn)方便、快速,但具有一定的交叉反應(yīng),特異性不強(qiáng)。滴金免疫(金標(biāo))滲濾法(DIGFA)是一種新近發(fā)展起來的免疫標(biāo)記技術(shù),近年來報(bào)道應(yīng)用衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲抗原(PwA)金標(biāo)滲濾試劑盒(DIGFA)檢測同源肺吸蟲病病人血清抗體敏感性可達(dá)98.8%和98.9%,特異性可達(dá)93.0%和94.8%[5-6],證明應(yīng)用于衛(wèi)氏肺吸蟲病流行地區(qū)具有敏感性高,特異性強(qiáng),操作簡便、快速,不需要特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn),適用于臨床檢驗(yàn)和現(xiàn)場應(yīng)用。湖北省十堰地區(qū)為斯氏肺吸蟲病流行地區(qū),本次用DIGFA和IEST檢測流行區(qū)居民和病鼠血清抗體,陽性率均為5.08%和100%。表明這兩種方法用于斯氏肺吸蟲病的檢測均具有較好的敏感性和特異性,在斯氏肺吸蟲病抗體的檢測中,不僅為較好的手段,而且這兩種方法彼此間檢測結(jié)果呈較好的一致性,并均具有早期診斷價(jià)值。

李調(diào)英等[7]報(bào)道衛(wèi)氏肺吸蟲成蟲抗原(PwA)和斯氏貍殖吸蟲成蟲抗原(PsA)對同源及異源肺吸蟲病人血清反應(yīng)都有較好的敏感性和特異性。作者應(yīng)用PwA抗原制備的DIGFA試劑盒檢測斯氏貍殖吸蟲病流行地區(qū)人群血清,斯氏肺吸蟲大鼠血清和其它對照血清,檢測結(jié)果與IEST試驗(yàn)結(jié)果基本一致。說明Pw和Ps有很多共同的特異抗原組份,決定了它們能與異源肺吸蟲病人血清IgG有效的特異結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺吸蟲病DIGFA診斷試劑盒和IEST用于斯氏肺吸蟲病血清學(xué)檢測具有簡便、快速、敏感性和特異性較好,結(jié)果易于判斷等優(yōu)點(diǎn)。因此,在斯氏肺吸蟲病流行地區(qū)進(jìn)行臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查時(shí),可選用其中一種方法,作為病原學(xué)診斷的替代方法,上述二種血清學(xué)試驗(yàn)方法均具有較大的實(shí)用價(jià)值。

[1]張光玉,郭鄂平.十堰地區(qū)肺吸蟲病區(qū)域分布及流行病學(xué)[J].鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,16(1):23.

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[3]郭鄂平,朱潔,張光玉,等.斯氏貍殖吸蟲病53例臨床資料分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(2):147-149.

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[5]干小仙,施曉華,王越,等.肺吸蟲病抗體快速檢測試劑盒(金標(biāo)滲濾法)的研制和應(yīng)用[J].中國人獸共患病雜志,2005,21(11):988-990.

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[7]李調(diào)英,徐亮,曾明安.衛(wèi)氏和斯氏肺吸蟲抗原對同源及異源肺吸蟲病診斷價(jià)值的比較[J].實(shí)用寄生蟲病雜志,2000,6(2):86-87.