丁 雪,羅曉東,羅潔琳,李小敏,沈浩賢,陳代雄

近幾十年來,各種變態(tài)反應(yīng)性疾病如過敏性鼻炎、皮炎、支氣管哮喘和變應(yīng)性結(jié)膜炎等的流行呈逐年上升趨勢[1],已成為全球性的健康問題[2]。變態(tài)反應(yīng)性疾病是接觸變應(yīng)原后人體產(chǎn)生的一種免疫病理反應(yīng)過程[3]?，F(xiàn)有資料證明[4],塵螨是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病最重要的變應(yīng)原之一。而塵螨中又以粉塵螨(Dermatophagoidesf arinae)和屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)數(shù)量最多、分布最廣、危害最大[5-7]。但是一方面屋塵螨和粉塵螨的分布不完全相同,另一方面兩者又常在同一環(huán)境中同時存在,因此了解某一地區(qū)或環(huán)境中塵螨的種類和優(yōu)勢螨種,對過敏性疾病的診斷、預(yù)防和治療是非常重要的。本研究嘗試用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)對粉塵螨和屋塵螨進(jìn)行鑒別和檢測。

1 材料和方法

1.1 試劑 粉塵螨原種由中山醫(yī)學(xué)院提供,在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)繁殖用于實(shí)驗(yàn);屋塵螨購自瑞典Al-lergon公司。DNA聚合酶、PCR試劑盒和 DNA Marker從 TAKARA公司購買。其它試劑:如乙醇、酚、氯仿、異戊醇均為分析純。

1.2 儀器 1-15PK離心機(jī)為SIGMA公司生產(chǎn);S1000TMPCR儀由BIORAD公司生產(chǎn);WS-01恒溫恒濕培養(yǎng)箱由湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 粉塵螨和屋塵螨DNA提取 參照趙亞娥[8]和王繼英[9]等報告的方法進(jìn)行。

1.3.2 隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增 參考陳觀今等[10]的研究報告設(shè)計隨機(jī)引物,由Invitrogen公司合成。兩條引物分別為 RP1、RP3,序列如下:RP1:5'-GAG GCC AGT-3';RP3:5'-GCA ACG CAA T-3'。分別以粉塵螨和屋塵螨DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系 25μL(5×PCR Buffer 5μL,上下游引物各 1μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,模板0.5μL,PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.5μL,ddH2O 13μL);反應(yīng)條件參考趙亞娥[8]、周華云等[11]報告:94℃5min預(yù)變性,94℃ 1min、36℃1min、72℃2min反應(yīng)45個循環(huán),72℃延伸 10min。產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下觀察并拍照。

1.3.3 測序 將隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物交給TAKARA公司,對所選取的條帶進(jìn)行DNA測序分析。

1.3.4 PCR引物設(shè)計 根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計可用于粉塵螨或屋塵螨檢測的PCR引物。為使引物符合其設(shè)計要求,對引物的個別堿基進(jìn)行了替換,序列如下:

根據(jù)粉塵螨約750bp大小DNA擴(kuò)增片段設(shè)計引物:

根據(jù)屋塵螨約500bp大小片段設(shè)計引物:

1.3.5 PCR擴(kuò)增粉塵螨和屋塵螨DNA 用新設(shè)計的引物,按照1.3.2的PCR反應(yīng)條件(退火溫度調(diào)整為48℃),分別對粉塵螨和屋塵螨的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.6 PCR反應(yīng)特異性 用新設(shè)計的屋塵螨的引物擴(kuò)增粉塵螨 DNA;用粉塵螨引物擴(kuò)增屋塵螨DNA,觀察這些引物的特異性。

1.3.7 PCR反應(yīng)敏感性 各取粉塵螨和屋塵螨DNA 0.25μL和0.1μL量按1.3.5的PCR 條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),以初步估計該法的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果 分別以粉塵螨和屋塵螨DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果見圖1。粉塵螨在750bp和500bp左右均有明顯條帶;而屋塵螨僅500bp左右條帶較清晰,無大于500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。

圖1 隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增粉塵螨和屋塵螨結(jié)果Fig.1 RP-PCR amplification results of D.f and D.p

2.2 測序和同源性分析 對粉塵螨750bp和500bp左右大小的兩個擴(kuò)增條帶(標(biāo)記為 df750、df500)與屋塵螨約500bp的一個擴(kuò)增條帶(標(biāo)記為dp500)進(jìn)行回收測序,結(jié)果如下。

2.2.1 df750測序和同源性分析結(jié)果

片段長度為666bp,劃線部分為設(shè)計引物f1,f2所在位置。

同源性分析:未發(fā)現(xiàn)與之高度同源序列,與其相似程度最高的基因?yàn)镃ollimonas sp.MPS11E8的3-氧?；?(酰載體蛋白)合酶,總的相似度為46%。

2.2.2 df500測序和同源性分析結(jié)果

同源性分析:未發(fā)現(xiàn)與之高度同源序列。

2.2.3 dp500測序和同源性分析結(jié)果

片段總長度為500bp。劃線部分為設(shè)計引物p1,p2所在位置。

同源性分析:未發(fā)現(xiàn)與之高度同源序列。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果 如圖2所示,粉塵螨和屋塵螨的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期的一致。

圖2 粉塵螨和屋塵螨PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of D.f and D.p

2.4 PCR反應(yīng)特異性 由圖3可看見,無論是粉塵螨還是屋塵螨,均無明顯的目的條帶出現(xiàn),表明引物具有較好的特異性。

圖3 粉塵螨和屋塵螨PCR反應(yīng)的特異性結(jié)果Fig.3 The specificity of PCR amplification

2.5 PCR反應(yīng)敏感性 如圖 4。在模板量為0.25μL和0.1μL的條件下,粉塵螨和屋塵螨均可擴(kuò)增出目的條帶,而0.1μL模板相當(dāng)于1.5只塵螨的DNA量,表明引物用于塵螨檢測應(yīng)具有較好的敏感性。

圖4 粉塵螨和屋塵螨PCR反應(yīng)敏感性結(jié)果Fig.4 The sensitivity of PCR amplification

3 討 論

目前,螨的分類和鑒別方法包括形態(tài)學(xué)方法[12]和分子生物學(xué)方法等。其中形態(tài)學(xué)分類和鑒別,由于粉塵螨和屋塵螨之間形態(tài)非常接近;同時,采樣過程中也可能造成螨體的損傷甚至殘缺,而給后續(xù)的形態(tài)鑒別工作帶來不便;此外,對于螨卵,幼螨的形態(tài)學(xué)鑒別則更為困難。分子生物學(xué)方法分類和鑒別方面,Yang B等[13]根據(jù)核糖體第二轉(zhuǎn)錄間隔(ITS2)和線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基(CO1)位點(diǎn)基因序列,用PCR方法嘗試對六種塵螨(包括屋塵螨,粉塵螨,熱帶無爪螨,埋里宇塵螨,腐食酸螨,橢圓板白螨)進(jìn)行分類。Suarez-Mzrtinez EB等[14]基于mtDNA 12SRNA的13條序列片段,對屋塵螨、熱帶無爪螨、隱秘甘螨和橢圓板白螨4種螨進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析。此外我國學(xué)者羅萍[15]用4對隨機(jī)引物對腐酪食螨和屋塵螨基因組DNA進(jìn)行分析,提示其DNA存在可鑒別的異質(zhì)性。但利用隨機(jī)引物PCR進(jìn)行粉塵螨和屋塵螨的鑒別目前尚未見文獻(xiàn)報道。本研究首次嘗試用該法對粉塵螨和屋塵螨DNA進(jìn)行了擴(kuò)增,結(jié)果顯示:此方法對這兩種塵螨有較好的鑒別作用。這也為粉塵螨和屋塵螨的鑒別和分類提供了一項新的手段。

本研究還對3個粉塵螨和屋塵螨的DNA片段進(jìn)行了序列測定。經(jīng)同源性分析,未發(fā)現(xiàn)與之高度同源的序列,因此這3個片段有可能為新的基因片段,其具體功能還有待進(jìn)一步的研究。此外,在這3個DNA片段中,df500與dp500由同一對引物擴(kuò)增得到,且片段長度非常接近,但測序發(fā)現(xiàn)二者并非相同或相似的一段DNA序列。上述DNA序列的測定為粉塵螨和屋塵螨的遺傳背景研究提供了新的信息,并為用分子生物學(xué)技術(shù)對塵螨進(jìn)行進(jìn)一步的研究提供了可能。

文獻(xiàn)報道[16]:塵螨的致病作用與環(huán)境中塵螨的密度有關(guān)。每1g灰塵中包含100只塵螨就會導(dǎo)致人體致敏,每1g灰塵中超過500只塵螨就會引發(fā)過敏性體質(zhì)者哮喘等過敏性疾病的發(fā)作。因此,對環(huán)境中塵螨及其密度的檢測于過敏性疾病的診斷、預(yù)防和治療都有重要意義。目前,塵螨的檢測方法主要有鏡檢計數(shù)檢查[7]、免疫學(xué)檢測[17]、鳥嘌呤檢測[18]和酶學(xué)檢測[19]等。鏡檢計數(shù)是最傳統(tǒng)的方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是檢測成本低,結(jié)果直觀可靠并可對多種螨進(jìn)行計數(shù),但是該方法工作量大,且檢測過程中殘缺螨、變異螨和幼螨的識別存在困難。免疫學(xué)方法、鳥嘌呤檢測或酶學(xué)檢測是通過檢測灰塵中塵螨變應(yīng)原或塵螨排泄物的鳥嘌呤含量或變應(yīng)原酶活性來估計塵螨種類和數(shù)量的一種檢測方法。這些方法均屬于間接檢測方法,同時,免疫學(xué)反應(yīng)存在交叉反應(yīng),且不同螨種產(chǎn)生的變應(yīng)原也可能性質(zhì)相同,因此,其結(jié)果可能存在較大誤差,且難以提供環(huán)境中某種塵螨數(shù)量、優(yōu)勢塵螨的種類等重要信息。PCR技術(shù)具有敏感、快速、可進(jìn)行定量檢測等優(yōu)點(diǎn),且該方法直接檢測蟲源性DNA,較免疫學(xué)檢測方法有更好的特異性。因此,本研究初步嘗試用PCR方法對這兩種塵螨進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:該方法具有較好的特異性和敏感性。為進(jìn)一步將其實(shí)際應(yīng)用于環(huán)境中粉塵螨和屋塵螨的定性和定量檢測奠定了基礎(chǔ)。

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