河北省中醫(yī)院 郭喜軍 鄂 輝 張顏偉(石家莊050011)

李佃貴教授創(chuàng)立的“濁毒理論”為胃癌前病變的中醫(yī)藥治療提供了新的治療思路，本實驗采用高糖加辛辣刺激飲食建立濁毒內(nèi)蘊(yùn)證動物模型，繼以MNNG溶液自由飲用，雷尼替丁灌胃，從而制造胃癌前病變濁毒內(nèi)蘊(yùn)證大鼠模型，檢測相關(guān)癌基因指標(biāo)探討與濁毒之間的聯(lián)系，為濁毒證臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級健康雄性Wistar大鼠30只，5周齡，體質(zhì)量140 g±10 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物合格證編號:2004－0007。

1.1.2 試劑:甲硝基亞硝基胍 (MNNG):購自于日本東京，由石家莊勃盛化學(xué)試劑有限公司提供。鹽酸雷尼替丁膠囊:0.15 g/粒，中諾藥業(yè) (石家莊)有限公司。即用型Bcl－2、c－erbB－2、c－myc免疫組化染色試劑盒，DAB顯色劑，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實驗設(shè)備:酶聯(lián)免疫檢測儀:MK3，芬蘭雷勃;超低溫保存箱:MDF－382E，日本三洋;全自動洗板機(jī):8×12，美國;光學(xué)顯微鏡:CH－20，日本Olympus;電熱恒溫水箱:600型，天津;顯微攝像全自動圖像分析儀:HPIAS1000型，同濟(jì)千屏影像公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模:30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，即正常組 (A組)、濕熱證胃癌前病變組 (B組)和模擬濁毒內(nèi)蘊(yùn)胃癌前病變組 (C組)，各組動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。正常組普通喂養(yǎng)。造模組大鼠自第2周開始每日自由飲用200μg/m L的MNNG(塑料瓶用黑色塑料袋嚴(yán)密包裹避光)，并且采用0.03 g/mL的雷尼替丁溶液灌胃，造模組每只大鼠灌胃1 mL;造模組在普通飼料喂養(yǎng)的同時在飼料中混合以適量的蜂蜜和辣椒油，上述造模共持續(xù)8周。造模8周后從對照組、濕熱模型組與模擬濁毒證組各隨機(jī)抽取2只大鼠殺檢，病理學(xué)檢查符合胃癌前病變病理診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］說明造模成功。造模成功后，濕熱組給予自由飲水，普通飲食2周。模擬濁毒組大鼠繼續(xù)給予高糖加辛辣刺激食物喂養(yǎng)2周。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理:濕熱組與正常組大鼠禁食不禁水24 h，經(jīng)斷頭處死后，暴露并游離其胃部，距賁門和幽門1.5 cm處離斷取出全胃，沿胃大彎側(cè)剪開，并用生理鹽水沖洗后從胃竇部取材，4%多聚甲醛固定。模擬濁毒組標(biāo)本采集同以上兩組。后經(jīng)光鏡切片制作與3種癌基因免疫組化染色。

1.2.3 一般觀察指標(biāo):觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、大便、飲食情況及大鼠的毛色，并對大鼠的肛溫情況進(jìn)行觀察。

1.2.4 免疫組化染色結(jié)果判斷:實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。判斷標(biāo)準(zhǔn):bcl－2以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性;c－myc以細(xì)胞質(zhì)染色出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性;c－erbB－2以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性。按陽性細(xì)胞百分比法:陽性細(xì)胞數(shù)＞25%為陽性。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 正常組大鼠反應(yīng)敏捷，毛色光澤，形體較肥胖，飲食量較其他各組大，大便呈顆粒狀，質(zhì)可。濕熱組大鼠形體消瘦，皮毛見松散，精神不振，食量較正常組減少，反應(yīng)較遲鈍，大便氣味臭穢，質(zhì)多偏黏或干稀不調(diào)。濁毒內(nèi)蘊(yùn)組大鼠皮毛見松散枯槁，食量明顯減少，眼神渙散，形體枯瘦，反應(yīng)遲鈍，大便質(zhì)黏或干稀不調(diào)。

2.2 3組大鼠肛溫變化比較 結(jié)果見表1。

2.3 3組大鼠Bcl－2、c－erbB－2、c－myc 3種癌基因的陽性表達(dá)率比較 結(jié)果見表2。

表1 3組肛門溫度比較(℃，n=8，±s)

表1 3組肛門溫度比較(℃，n=8，±s)

組別7 d 60 d 75 d A組 37.20±0.16 37.14±0.11 37.22±0.13 B組 37.18±0.12* 38.22±0.19＊＊ 38.35±0.20＊＊C組 37.16±0.17* 38.17±0.23＊＊ 39.10±0.15＊＊#

注:與A組比較，*P＞0.05，＊＊P＜0.05;與B組比較，#P＜0.05

表2 3組Bcl－2、cerbB－2、c－myc陽性表達(dá)率比較 (%)

3 討論

胃癌前病變是一個病理性概念，包括腸上皮化生(IM)和異型增生 (Dys)，主要伴存于慢性萎縮性胃炎(CAG)中，是從正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)化過程中的一個重要階段，但其本身尚不具備惡性改變。恩師李佃貴教授創(chuàng)立的“濁毒理論”為胃癌前病變的診治提供了新的理論依據(jù)，但目前實驗研究機(jī)制并未成熟，尚缺乏有效的實驗依據(jù)，因此本研究通過動物實驗建立濕熱證胃癌前病變的動物模型，并以中醫(yī)理論“濕熱日久化生濁毒”為依據(jù)，模擬濁毒證胃癌前病變模型，檢測相關(guān)癌基因指標(biāo)，為濁毒研究提供實驗依據(jù)。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為“濁”與濕類同，濁為陰邪，多把濁證分為尿濁、便濁、精濁等，取其重濁黏膩之意。毒，與熱類同，熱為毒之漸，毒為熱之極，毒屬陽邪。各種原因致脾胃功能失調(diào)，運(yùn)化失常，導(dǎo)致水濕積聚，化濕成濁，濁邪內(nèi)蘊(yùn)，郁而不解，氣機(jī)郁滯，郁久化熱，熱壅血瘀而成毒，濁毒內(nèi)蘊(yùn)而出現(xiàn)一系列臨床癥狀。濁與毒性質(zhì)不同，臨床上多膠著纏綿，相互影響，故并稱濁毒。

Bcl－2是一種新型原癌基因，定位于染色體18q21，編碼26kDa的蛋白，主要分布于核膜和胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可阻斷細(xì)胞的編程死亡而不影響細(xì)胞的增殖，是抑制細(xì)胞凋亡的重要因素，其過度表達(dá)主要通過延長細(xì)胞壽命，使異常細(xì)胞積聚而阻止凋亡的發(fā)生。［2－5］，c－myc癌基因定位于染色體8q24，有3個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，大量資料表明它作為細(xì)胞生長的正性調(diào)控物促進(jìn)細(xì)胞的增長，驅(qū)動細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)腫瘤增殖并明顯抑制細(xì)胞分化。［6］

c－erbB－2癌基因定位于染色體17q21，又稱為HER－2基因，編碼為一種跨膜酪氨酸激酶受體，即P185蛋白，屬于Ⅰ型生長因子受體，在細(xì)胞內(nèi)的部分有促進(jìn)酪氨酸激酶活性的作用，大量研究證實這個原癌基因?qū)τ谝鸷途S持許多人類惡性腫瘤的致癌階段有顯著意義。［7］

本實驗中通過給大鼠造模，并給大鼠飲食上模擬濁毒內(nèi)蘊(yùn)之證來觀察3種癌基因的陽性表達(dá)率。實驗結(jié)果表明，Bcl－2、c－erbB－2、c－myc 3種癌基因在造模成功后免疫組化染色結(jié)果中呈陽性表達(dá)甚至是強(qiáng)陽性表達(dá)，此說明癌基因的陽性表達(dá)率與中醫(yī)濁毒證型之間成正比例增長關(guān)系，大鼠肌體自身處于一種促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的拮抗、動態(tài)逐漸失衡的狀態(tài)，超出一定范圍便由生理轉(zhuǎn)變?yōu)椴±頎顟B(tài)。結(jié)果顯示本實驗造模方法符合濁毒致病機(jī)理與濁毒證表現(xiàn)，說明濁毒證的形成確實能引起癌基因的陽性表達(dá)率升高，濁毒的形成是導(dǎo)致胃癌前病變發(fā)生的一個重要致病因素。

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