徐麗娜，劉倩，＊宋慶軍

(菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東 菏澤 274000;?濟南市長清區(qū)人民醫(yī)院)

SPAG9mRNA在DAC干預A549細胞前后的表達

徐麗娜，劉倩，＊宋慶軍

(菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東 菏澤 274000;?濟南市長清區(qū)人民醫(yī)院)

目的 檢測DAC干預前后A549細胞中SPAG9的表達，探討SPAG9表達的生物學機制。方法實時熒光定量PCR（RQ-PCR）法檢測肺組織標本和DAC干預A549細胞前后SPAG9mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果DAC干預A549細胞前后SPAG9的表達差異性顯著,隨甲基化狀態(tài)的延長而減弱。結(jié)論低甲基化狀態(tài)抑制SPAG9表達。SPAG9在肺癌的早期高度表達，中晚期表達減弱，可作為肺癌早期診斷和治療的生物學參考指標之一。

SPAG9；腫瘤睪丸抗原；A549細胞

腫瘤睪丸抗原（cancer/testis antigens，CTA）是一類僅在睪丸組織正常表達或極少數(shù)正常器官組織中弱表達而在腫瘤組織表達增強的腫瘤相關抗原。SPAG9是2004年新發(fā)現(xiàn)的CTA家族中的一員，屬于c-junNH2-termina-kinase（JNK）相互作用蛋白家族（JIP）的新成員且僅在睪丸組織中表達。CT抗原在腫瘤中的表達機制的研究并不清楚，目前主要有兩方面解釋一是低甲基化狀態(tài)，二是組蛋白乙?；Ｎ覀冞x擇A549細胞株利用細胞的甲基化誘導抑制劑5-AZn-2’脫氧胞苷酸（DAC）對其干預，觀察DAC干預后細胞在低甲基化狀態(tài)SPAG9基因的表達情況，驗證低甲基化狀態(tài)下對于CT抗原在腫瘤細胞中表達的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞株 人肺腺癌A549細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器 1）RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）。2）新生牛血清（武漢三利生物制品廠）。3）5-AZn-2’脫氧胞苷酸（Sigma公司）。4）RQ-PCR試劑：DEPC購自Sigma公司，Trizol試劑、SS II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EB染料均購自Invitrogen公司。SYBR GREEN supermix試劑購自STRATAGENE公司，編號600548。 DNA Extraction kit膠回收試劑盒，MBI公司。TA克隆試劑盒購于Promega公司；質(zhì)粒小提試劑盒（Promega公司）。

引物合成：依據(jù)PCR引物的設計原則，首先在PUBMED數(shù)據(jù)庫中檢索SPAG9、GAPDH的全長mRNA序列，設計引物序列，引物由上海生工生物技術公司合成。SPAG9上游引物序列：GAGGACGGTGTGGTGTATCAG，下游引物序列：GTCATAGCGCCCGATAAGCC，擴增基因片段長度為120bp；以GAPDH為內(nèi)參照，上游引物序列：GCTGGTCATCAACGGGAAA，下游引物序列：ACGCCAGTAGACTCCACGACA；擴增基因片段長度為105bp。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)時間不同濃度DAC對肺癌A549細胞的影響試驗（干預） 取對數(shù)生長期A549細胞按1×104孔接種于20μl 96孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液200μl。設單細胞懸液，置5%CO2培養(yǎng)箱37°。設對照組（未干預組）和DAC干預組，終濃度分別為10、25、50、100μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24h、3d、5d、7d，在培養(yǎng)規(guī)定的時間后，每個濃度每個時間點設3個復孔。每孔加入20μlMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜200μl，用搖床振蕩5min，然后用在570nm處測OD值。細胞存活率=（DAC組A值/對照組A值）×100%。

1.2.2 RQ-PCR檢測 A549細胞株DAC干預前后SPAG 9mRNA表達。取對數(shù)生長期A549細胞按2×106孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)液800μl。5%CO2的條件下37℃培養(yǎng)24h后，設對照組和DAC干預組，干預組終濃度為100μmol/L。放置5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中細胞的傳代按常規(guī)方法進行，傳代后培養(yǎng)液中保持DAC的濃度。在培養(yǎng)規(guī)定的時間后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入1ml Trizol，室溫靜置5min后，將液體移入1.5ml離心管中。其余方法同組織實驗。實驗重復三次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，組間均數(shù)（以GAPDH為內(nèi)參，RQ-PCR以SPAG9拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)，WB法采用二者灰度值之比）比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時間及不同干預濃度對肺癌 A549細胞的影響試驗（干預）結(jié)果見表1。

嘧啶（5-MC）。目前認為DNA甲基化是基因表達調(diào)控的機制之一，主要通過以下三方面影響基因的轉(zhuǎn)錄：1）DNA的甲基化改變了DNA分子的空間構(gòu)象，從而影響基因表達。2）基因啟動子區(qū)域高甲基化狀態(tài)直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合。3）高甲基化的CpG通過特異的甲基化結(jié)合蛋白與組蛋白

表1 不同培養(yǎng)時間及不同干預濃度對肺癌A549細胞的影響試驗（±s）

表1 不同培養(yǎng)時間及不同干預濃度對肺癌A549細胞的影響試驗（±s）

劑量度 0d 1d 3d 5d 7d對照組 0.644±0.1720.587±0.5650.785±0.0600.839±0.0210.652±0.01010μmol/L 0.646±0.0320.644±0.0070.586±0.0500.609±0.0390.512±0.01025μmol/L 0.586±0.0460.543±0.0250.534±0.0120.515±0.0160.486±0.03550μmol/L 0.613±0.0260.561±0.0390.467±0.0210.434±0.0250.417±0.015100μmol/L 0.593±0.0280.541±0.0150.424±0.0130.397±0.0380.322±0.009

2.2 SPAG9mRNA在DAC干預A549細胞前后的表達 圖1顯示SPAG9PCR反應產(chǎn)物為長度120bp的片斷，與設計的引物相符，GAPDH圖片顯示PCR反應產(chǎn)物為一長度105bp的片斷，與設計的引物相符。

圖2示實時熒光定量PCR法檢測SPAG 9mRNA在DAC干預A549細胞后不同時間的表達水平。

3 討論

腫瘤睪丸抗原由于其在腫瘤中限制性表達而在正常組織不表達的特征使其作為腫瘤治療的靶標成為研究的新熱點。對此類抗原的研究多放在腫瘤的免疫治療和新抗原的發(fā)現(xiàn)方面，對于CT抗原的表達機制的研究較少。CT抗原在腫瘤中的表達的生物學機制尚不清楚。DNA甲基化異常是腫瘤的一個較普遍的特征，也是細胞惡變的早期現(xiàn)象并參與腫瘤的進展。它主要表現(xiàn)為癌基因的低甲基化和抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化。目前研究表明，癌基因DNA的低甲基化可激活癌基因的表達，而抑癌基因DNA的高甲基化可使抑癌基因的表達失活，其結(jié)果類同于基因缺失或突變而造成的基因功能喪失，導致腫瘤的發(fā)生[1-3]。癌基因低甲基化在惡性腫瘤中廣泛存在[4-5]。在實體瘤如轉(zhuǎn)移的肝細胞癌[6]、前列腺癌[7]以及在惡性血液病如B-細胞慢性淋巴細胞性白血病[8]中都很普遍。低甲基化程度與與惡性程度呈正比關系。

DNA甲基化主要指在CPG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上加上一個甲基基團，形成5甲基胞去乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）協(xié)同作用，增強HDAC去乙?；幕钚?，從而導致基因轉(zhuǎn)錄失活[9]。

由于DNA的甲基化不涉及DNA序列本身的改變，所以這種改變是可逆的，因此可以通過消除基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，在癌變過程中，使異常甲基化逆轉(zhuǎn)，特別是癌變早期的轉(zhuǎn)變對腫瘤的防治尤為重要。DAC是脫氧胞苷的類似物，可以通過整合

入DNA，進而干擾DNA對甲基的接受能力，或直接抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，最終導致DNA甲基在細胞分裂周期中進行性丟失產(chǎn)生低甲基化，從而使某些基因重新激活。

我們選擇A549細胞株在DAC不同劑量及不同時間段干預后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，A549細胞出現(xiàn)明顯的皺縮、死亡，細胞密度有不同程度的減少。在一定的范圍內(nèi)，隨著劑量的增高和作用時間的延長，對肺癌細胞增殖的抑制作用越明顯。這與文獻報道DAC抑制腫瘤細胞增生，誘導細胞凋亡的作用相符合。我們利用DAC干預后使A549細胞處于低甲基化狀態(tài)進一步來檢測SPAG9在A549細胞干預前后的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPAG9的基因表達較對照組顯著減弱，實驗組在1d、3d、5d、7d四個時間點也呈現(xiàn)表達的逐步減弱，各時間段間比較差異顯著。這個結(jié)果與前面我們在肺癌組織中的發(fā)現(xiàn)是相呼應一致的。這也證實SPAG9在肺癌的早期高度表達，在中晚期表達減弱，可作為肺癌早期診斷和治療的生物學參考指標之一。

綜上所述，通過對A549腺癌細胞株的DAC干預，在不同時間段檢測細胞中SPAG9的表達異常。我們發(fā)現(xiàn)A549細胞在低甲基化狀態(tài)下，SPAG9的基因和蛋白質(zhì)的表達隨低甲基化程度增強而減弱。這從另一方面也證實了SPAG9在肺癌中的早期高度表達，中晚期表達減弱，可作為肺癌早期診斷和治療的生物學參考指標之一。

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R318;Q2

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1008-4118（2011）02-0018-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2011.02.08

2011-04-04