紀(jì)敦敦，邱宏端，謝航

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108)

光合細(xì)菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中良好的微生態(tài)制劑。大量研究表明，光合細(xì)菌能有效降低養(yǎng)殖水體的污染程度，如降低水體中有機(jī)物、氨氮與亞硝酸鹽氮的濃度，提高水體中的溶氧等［1－3］。目前國內(nèi)外均已將光合細(xì)菌作為養(yǎng)殖水質(zhì)凈化菌劑，并且進(jìn)入生產(chǎn)性應(yīng)用階段。如東南亞各國、日本和中國的養(yǎng)魚池和養(yǎng)蝦池中均已較普遍地利用光合細(xì)菌來改善水質(zhì)，且取得較好的效果［4－6］。光合細(xì)菌降解亞硝酸鹽氮的效能大多為30% ～90%［7－9］，而對(duì)氨氮的降解率一般只有20% ～60%［10－11］，且對(duì)氨氮降解效能高的菌種通常降解亞硝酸鹽氮的效果不佳［2，11］，而對(duì)亞硝酸鹽氮降解高的菌種降解氨氮的效果也較差，這在一定程度上影響了菌劑的應(yīng)用效果。為此，選育一種能同時(shí)凈化養(yǎng)殖水體中氨氮與亞硝酸鹽氮的高效光合細(xì)菌優(yōu)良菌株，對(duì)進(jìn)一步促進(jìn)與推廣其生態(tài)養(yǎng)殖的應(yīng)用及效果具有重要意義。

原生質(zhì)體融合是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的基因重組技術(shù)［12］，目前已成為菌種改良的重要手段之一。原生質(zhì)體融合與其它基因重組方式相比，具有不受種屬限制、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更大的重組幾率以及能提高育種速度等優(yōu)點(diǎn)［13－14］?；谠|(zhì)體融合選育菌種的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室前期已選育的耐鹽紅螺菌Rhodospeudomonas capsulate(降解亞硝酸鹽氮90%以上)與假絲酵母菌Candida sp.(降解氨氮80%以上)的基礎(chǔ)上，本研究中作者以兩種高效凈化水質(zhì)的功能菌為試驗(yàn)菌株，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育提高耐鹽紅螺菌對(duì)氨氮的降解效能，旨在選育一種能高效降解氨氮和亞硝酸鹽氮的光合細(xì)菌，并進(jìn)一步應(yīng)用于水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 耐鹽紅螺菌 (編號(hào)C12)［15］和假絲酵母菌 (編號(hào)B)［16］均為實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (g/L):光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括CH3COONa 3.0，NaCl 1.0，(NH4)2SO40.3，MgSO40.2，KH2PO40.5，K2HPO40.3，CaCl20.05，酵母膏 0.1，MnSO40.025，F(xiàn)eSO40.005，蛋白胨0.01，谷氨酸0.0002，pH為7.4，在121℃下滅菌20min。酵母菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，pH為自然值，在115℃下滅菌20 min。

2)高滲再生培養(yǎng)基:由光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%的蔗糖制成。

3)融合子篩選選擇培養(yǎng)基:在高滲再生培養(yǎng)基中添加制霉菌素原液和鏈霉素原液，使其最終濃度均達(dá)到100 U/mL。

4)養(yǎng)殖水體培養(yǎng)基:以淡水魚塘的養(yǎng)殖水為基質(zhì) (經(jīng)濾紙過濾)，添加氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液 (NH4Cl溶液，氨氮濃度為1000 μg/mL)與亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)溶液 (NaNO2溶液，亞硝酸鹽氮濃度為1000 μg/mL)，配成 pH為 7.0，氨氮濃度為 9～10 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度為1～2 mg/L的養(yǎng)殖水體培養(yǎng)基。在121℃下滅菌20 min備用。

1.1.3 試劑 Tris－HCl緩沖液包括0.2 mol/L Tris 10 mL，0.2 mol/L HCl 17 mL，蒸餾水13 mL，pH為 7.36。SMM緩沖液包括 蔗糖 170g/L，MgCl2·6 H2O 4.1 g/L，順丁烯二酸 2.3 g/L，pH為6.7。以上緩沖液配制后在115℃下滅菌20 min。

制霉菌素原液是用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇配制成10000 U/mL的溶液。鏈霉素原液是用無菌水配制成10000 U/mL溶液。PEG溶液:含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的PEG－6000、50 mmol/L CaCl2的SMM溶液。蝸牛酶:用山梨醇 (0.8 mmol/L，pH為6.5，115℃下滅菌20 min)分別配制成濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL的溶液。溶菌酶:用SMM緩沖液分別配制成濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL的溶液。以上試劑使用前均進(jìn)行過濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 兩種親株生長曲線的測(cè)定

1)耐鹽紅螺菌 挑取斜面菌種接種于10 mL光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于30℃光照條件下培養(yǎng)2 d，然后以5%的接種量繼續(xù)接種于培養(yǎng)基(在250 mL三角瓶中加入100 mL培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，并在不同的培養(yǎng)時(shí)間取樣，用分光光度法(OD660nm)測(cè)定其細(xì)胞生物量，描繪其生長曲線。

2)假絲酵母菌 挑取斜面菌種接種于10 mL酵母菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于30℃下以100 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，后以5%的接種量繼續(xù)接種于三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在不同的培養(yǎng)時(shí)間取樣，用分光光度法 (OD560nm)測(cè)定細(xì)胞生物量，描繪其生長曲線。

1.2.2 兩種親株的抗性鑒定 分別在酵母菌、光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為1%的制霉菌素、鏈霉素原液［17］及兩種抗菌素原液，并振蕩均勻制作成平板。將兩種親株分別劃線在含單種及兩種抗生素的平板上，將假絲酵母菌置于30℃恒溫下培養(yǎng)1 d，將耐鹽紅螺菌置于光照條件下培養(yǎng)3 d(30℃)，觀察兩種親株在不同抗菌素平板上的生長情況。

1.2.3 兩種親株原生質(zhì)體的制備與再生

1)耐鹽紅螺菌 吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌液1.5 mL置于離心管中，離心 (10000 r/min離心5 min，下同)，棄掉上清液，菌泥用Tris－HCl緩沖液進(jìn)行洗滌、離心，反復(fù)兩次。然后添加EDTA、溶菌酶溶液作用于細(xì)胞制備原生質(zhì)體，待反應(yīng)結(jié)束后離心除去溶菌酶，并用SMM緩沖液洗滌兩次，生成的原生質(zhì)體懸于SMM緩沖液中備用。同時(shí)根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表 (表1)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，探討不同濃度的EDTA、溶菌酶溶液和不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)菌種制備原生質(zhì)體的影響。此外，吸取0.5 mL原生質(zhì)體懸液，用SMM緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，涂布于高滲再生培養(yǎng)基上，30℃下光照培養(yǎng)7 d，以觀察其再生情況。

表1 耐鹽紅螺菌正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factor levels in orthogonal test of Rhodospeudomonas capsulata

2)假絲酵母菌 吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌液1.5 mL置于離心管中，離心 (以10000 r/min離心5 min，下同)，棄掉上清液，菌泥用Tris－HCl緩沖液進(jìn)行洗滌、離心，反復(fù)兩次。將其置于含有巰基乙醇、EDTA的溶液中，在37℃、搖床條件下以200 r/min離心15 min，除去上清液，并添加蝸牛酶溶液作用于細(xì)胞制備原生質(zhì)體，待反應(yīng)結(jié)束后離心除去蝸牛酶，用SMM緩沖液洗滌、沉淀兩次，將生成的原生質(zhì)體懸于SMM緩沖液中備用。同時(shí)根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表 (表2)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，探討不同濃度的巰基乙醇、EDTA、蝸牛酶溶液和不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)菌種制備原生質(zhì)體的影響。此外，吸取0.5 mL原生質(zhì)體懸液，用SMM緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，涂布于高滲再生培養(yǎng)基上，30℃下恒溫培養(yǎng)2 d，以觀察其再生情況。

表2 假絲酵母菌正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Factor levels in orthogonal test of Candida sp.

3)原生質(zhì)體形成率、再生率的計(jì)算

其中:A為未經(jīng)酶處理的菌液在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù);B為經(jīng)酶處理后的菌液在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù);C為經(jīng)酶處理后的菌液在高滲再生培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)體融合 分別吸取兩種原生質(zhì)體制備液0.75 mL于試管中，輕輕混勻后進(jìn)行離心，棄上清液，加入PEG溶液1.5 mL，置于30℃下水浴中反應(yīng)10 min，離心，除去 PEG，將沉淀物用SMM溶液洗滌兩次，后懸浮在1 mL SMM溶液中，并將菌液涂布在添加有兩種抗菌素的選擇培養(yǎng)基平板上，在30℃、光照條件下培養(yǎng)7 d，挑取生長的菌落初步獲得融合子細(xì)胞。

1.2.5 融合子篩選 從含有兩種抗菌素的選擇培養(yǎng)基平板上挑取菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代試驗(yàn)觀察各菌株情況。將經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)均生長良好的菌株進(jìn)行水質(zhì)凈化試驗(yàn)。具體步驟如下:挑取融合子斜面菌接種于10 mL光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在30℃、光照下培養(yǎng)2 d，然后以5%的接種量接種于養(yǎng)殖水中，在30℃、100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 d，取樣測(cè)定養(yǎng)殖水中的氨氮、亞硝酸鹽氮的含量。采用納氏試劑比色法測(cè)定氨氮含量［18］，采用N－(1－萘基)－乙二胺光度法測(cè)定亞硝酸鹽氮的含量［19］。相關(guān)計(jì)算公式如下:

其中:ρ0、ρ1分別為接入菌種前后氨氮、亞硝酸鹽氮濃度。

氨氮降解效能增長率=(融合子降解率－耐鹽紅螺菌降解率)/耐鹽紅螺菌降解率×100%。

1.2.6 融合子R1菌株的形態(tài)與生長特征

1)形態(tài)特征 將篩選的融合子R1菌株與兩種親株分別接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后進(jìn)行染色鏡檢，觀察其菌落特征的差異。

2)生長曲線 將融合子R1菌株與兩種親株分別接種于試管培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后以5%的接種量接種于三角瓶光合細(xì)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其細(xì)胞生物量，描繪其生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種親株的生長曲線

微生物生理狀態(tài)是原生質(zhì)體化的重要影響因素［20］。大多數(shù)研究表明，處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞生長代謝旺盛，細(xì)胞壁對(duì)酶解作用最為敏感，由這些細(xì)胞分離原生質(zhì)體其原生質(zhì)體的形成率和再生率都較高［21］。由于對(duì)數(shù)期初期菌量較少，而對(duì)數(shù)期末期細(xì)胞對(duì)酶的作用變得不太敏感［22］，為此，制備原生質(zhì)體通常選擇對(duì)數(shù)期中期的菌進(jìn)行破壁。本研究中，對(duì)兩種親株的生長曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明:假絲酵母菌生長周期約2 d，培養(yǎng)6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，約31 h到達(dá)對(duì)數(shù)期后期，其生長對(duì)數(shù)期中期為15～16 h;耐鹽紅螺菌的生長周期約為4 d，培養(yǎng)2 d到達(dá)對(duì)數(shù)期末期，對(duì)數(shù)生長期中期約為36 h(圖1)。這說明制備假絲酵母菌的原生質(zhì)體培養(yǎng)菌齡為15～16 h較為適宜;制備耐鹽紅螺菌原生質(zhì)體的培養(yǎng)菌齡為36 h較為適宜。

2.2 兩種親株對(duì)制霉菌素和鏈霉素的抗性

融合子的篩選是原生質(zhì)體融合能否取得成功的一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，利用抗藥性標(biāo)記篩選融合子是常用的方法之一。微生物的抗藥性是菌種的重要特性，是由遺傳物質(zhì)決定的，不同種的微生物對(duì)某一種藥物的抗性存在差異，利用這種差異即可對(duì)融合子進(jìn)行選擇［17］。本研究中對(duì)兩種親株的抗性進(jìn)行鑒定，耐鹽紅螺菌只在添加制霉菌素的培養(yǎng)基上生長，假絲酵母菌只在添加鏈霉素的培養(yǎng)基上生長，兩種親株在同時(shí)添加制霉菌素和鏈霉素的培養(yǎng)基上均不能生長 (表3)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種親株對(duì)試驗(yàn)抗菌素的抗藥性不同，篩選兩種親株的原生質(zhì)體融合子可用添加兩種抗生素的培養(yǎng)基作為初篩選擇培養(yǎng)基。

圖1 假絲酵母菌和耐鹽紅螺菌的生長曲線Fig.1 The growth curves of Candida sp.，and Rhodospeudomonas capsulata

表3 耐鹽紅螺菌與假絲酵母菌對(duì)抗菌素的抗藥性Tab.3 The resistance of the two bacterial strains to nystatin and streptomycin

2.3 兩種親株原生質(zhì)體形成率與再生率的正交試驗(yàn)

2.3.1 耐鹽紅螺菌 耐鹽紅螺菌屬于革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，僅利用溶菌酶處理得到的原生質(zhì)體不利于融合。有研究表明，部分陽離子可明顯抑制溶菌酶的活性，如基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有的Mg2+［23］。通常選擇加入EDTA處理以獲得較好效果，因?yàn)镋DTA作為螯合劑可避免金屬離子對(duì)酶的抑制作用，因而提高了原生質(zhì)體的形成率［23］。正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果表明 (表4):影響耐鹽紅螺菌原生質(zhì)體形成因素的主次順序?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間＞酶量＞EDTA濃度，其最優(yōu)組合為A1B3C2，即EDTA濃度為0.1 g/L、酶量為1.5 mg/mL、時(shí)間為45 min，采用該優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其原生質(zhì)體形成率為99.9%，再生率為8.7%;影響耐鹽紅螺菌原生質(zhì)體再生的因素主次順序?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間＞酶量＞EDTA濃度，其最優(yōu)組合為 A1B2C1，即EDTA濃度為0.1 g/L、酶量為1.0 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間為30 min，采用該優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其原生質(zhì)體的形成率為80.5%，再生率為15.2%。比較耐鹽紅螺菌原生質(zhì)體制備與再生優(yōu)化條件的驗(yàn)證結(jié)果，可以看出，在制備的優(yōu)化條件下原生質(zhì)體的形成率很高，而在再生的優(yōu)化條件下原生質(zhì)體的形成率較低。由于原生質(zhì)體形成率的高低直接影響著細(xì)胞融合頻率，因此，本試驗(yàn)中選擇原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件進(jìn)行后續(xù)研究。

表4 耐鹽紅螺菌L9(34)的正交試驗(yàn)及結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal test for Rhodospeudomonas capsulata L9(34)

2.3.2 假絲酵母菌 假絲酵母細(xì)胞壁是由內(nèi)層的葡聚糖層和外層的甘露聚糖－蛋白質(zhì)層構(gòu)成，成分和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。因此，除了添加蝸牛酶之外，還以EDTA和巰基乙醇作為前處理。研究表明，部分陽離子可明顯抑制蝸牛酶的活性［24］，如基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可能含有的Fe3+，因此加入EDTA作為螯合劑;而巰基乙醇能夠還原外層蛋白質(zhì)中的二硫鍵，增加外層壁的通透性，增強(qiáng)蝸牛酶的作用［25］。假絲酵母菌的原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化采用正交試驗(yàn)方法。正交試驗(yàn)結(jié)果表明 (表5):影響假絲酵母菌原生質(zhì)體形成因素的主次順序?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間＞巰基乙醇濃度＞酶量＞EDTA濃度，其最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即巰基乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%、EDTA濃度為1 g/L、酶量為0.5 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間為30 min。采用該優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，其原生質(zhì)體形成率為61.0%，再生率為36.1%;影響假絲酵母菌原生質(zhì)體再生的因素主次順序?yàn)閹€基乙醇濃度＞EDTA濃度＞反應(yīng)時(shí)間＞酶量，其最優(yōu)組合為A1B2C3D1，即巰基乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%，EDTA濃度為2 g/L，酶量為1.5 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為30 min。采用該優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，其原生質(zhì)體形成率為52.3%，再生率為39.7%。比較假絲酵母菌的制備與再生優(yōu)化條件，均可發(fā)現(xiàn)其形成率低于耐鹽紅螺菌，但其原生質(zhì)體的再生率較高，假絲酵母菌原生質(zhì)體的形成率與再生率受反應(yīng)時(shí)間、EDTA、酶量和巰基乙醇濃度的影響較大。比較其制備和再生的優(yōu)化條件驗(yàn)證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)再生率相差不大，但在制備優(yōu)化條件下形成率較高。為此，選擇制備的優(yōu)化條件進(jìn)行后續(xù)研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩株親株菌的原生質(zhì)體制備與再生條件以及所獲得的結(jié)果存在較大差異。這可能由于其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成存在的差異所致。

2.4 融合子篩選

本試驗(yàn)中選用的耐鹽紅螺菌親株只具有抗制霉菌素的特性，假絲酵母菌只具備抗鏈霉素的特性，但采用含鏈霉素和制霉菌素的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基挑選的融合子卻具有雙抗特性。雙抗特性反映出雙親的抗性通過融合的渠道實(shí)現(xiàn)了統(tǒng)一，這可以作為其實(shí)現(xiàn)融合的有力證據(jù)。

將耐鹽紅螺菌與假絲酵母菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合后，從選擇培養(yǎng)基上共挑取了13個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接于斜面，培養(yǎng)后置于4℃下保存。將其在光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，經(jīng)過連續(xù)傳代，觀察各菌株生長的穩(wěn)定性，最后選出6株生長良好的融合子接入養(yǎng)殖水體培養(yǎng)基，進(jìn)行氨氮、亞硝酸鹽氮降解效能復(fù)篩。從表6可見，融合子各菌株與耐鹽紅螺菌一樣具有高效降解亞硝酸鹽氮的效能，而氨氮降解效能較假絲酵母菌低，但與耐鹽紅螺菌親株相比也有了較大幅度的提高。其中融合子R1菌株是降解效能較好的菌株，對(duì)水體中亞硝酸鹽氮的降解率達(dá)98%，對(duì)氨氮的降解率達(dá)63%(較耐鹽紅螺菌提高54%)。

表5 假絲酵母菌L9(34)的正交試驗(yàn)及結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal test L9(34)for Candida sp.

2.5 融合子R1菌株的形態(tài)特征與生長特性

2.5.1 形態(tài)特征 對(duì)融合子R1菌株與兩種親株的細(xì)胞形態(tài)和菌落進(jìn)行觀察，結(jié)果見表7。由表7可見，融合子R1的個(gè)體形態(tài)、菌落特征與耐鹽紅螺菌較為相似。

2.5.2 生長曲線 對(duì)融合子R1菌株與兩種親株在液體培養(yǎng)過程的細(xì)胞生物量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。由圖2可見:假絲酵母菌的生長特征與融合子R1及耐鹽紅螺菌差異較大，而融合子R1的生長周期與耐鹽紅螺菌較為相似，即培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)48 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，且兩種菌的細(xì)胞最大生物量也較為相似。

表6 融合子與兩種親株凈化水質(zhì)的效能比較Tab.6 The degradation comparison of fusants with the bacterial strains

圖2 融合子與兩種親株的生長曲線比較Fig.2 The comparison of cultural curves between fusants and the two brood strains

表7 融合子與親株的形態(tài)特征比較Tab.7 The morphological comparison between fusants and the bacterial strains

3 結(jié)論

1)氨氮和亞硝酸鹽氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中化合態(tài)氮的兩種存在形式，對(duì)水生動(dòng)物均有較大的毒性［26］。本研究中以選育雙重高效降解氨氮、亞硝酸鹽氮的光合細(xì)菌為目標(biāo)，利用實(shí)驗(yàn)室前期選育保存的高效凈化養(yǎng)殖水體的功能菌 (假絲酵母菌對(duì)氨氮的降解率達(dá)80%以上，耐鹽紅螺菌對(duì)亞硝酸鹽氮的降解率達(dá)90%以上)為試驗(yàn)菌株，通過正交試驗(yàn)對(duì)兩種親株的原生質(zhì)體制備與再生條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，耐鹽紅螺菌原生質(zhì)體的形成率達(dá)99.9%，再生率為8.7%;假絲酵母菌原生質(zhì)體的形成率為61.0%，再生率為36.1%。耐鹽紅螺菌在試驗(yàn)條件下其原生質(zhì)體的形成率高于假絲酵母菌，但其再生率低于假絲酵母菌。這可能是由于兩種菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成差異較大所致。

2)將兩種親株的原生質(zhì)體在聚乙二醇 (PEG－6000)和Ca2+的誘導(dǎo)下進(jìn)行融合試驗(yàn)，通過選擇培養(yǎng)基對(duì)融合子進(jìn)行初篩，經(jīng)過多次傳代試驗(yàn)后，檢測(cè)6株生長穩(wěn)定的融合子對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮與亞硝酸鹽氮的降解效能，并將篩選的優(yōu)良菌株的形態(tài)和生長特性與原菌株進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，融合子R1菌株具有較好的降解效能，其降解亞硝酸鹽氮的效能與耐鹽紅螺菌相同，達(dá)到90%以上，其降解氨氮效能達(dá)到60%以上，較耐鹽紅螺菌親株提高了54%。融合子R1菌株細(xì)胞的形態(tài)大小、菌落特征與耐鹽紅螺菌均較為相似。

耐鹽紅螺菌可在鹽度為1～40條件下生長，是淡水、海水中均可使用的光合細(xì)菌。本研究中通過將耐鹽紅螺菌與假絲酵母菌的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得了對(duì)氨氮、亞硝酸鹽氮降解效能較好的融合子菌種，從而為光合細(xì)菌更好地用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)的凈化奠定了基礎(chǔ)。

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