孫向軍，羅琳，姜志強(qiáng)，孫硯勝，史東杰，梁擁軍

(1.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京100068;2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

錦鯉Ornmmental carp的色質(zhì)是決定其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，影響魚(yú)體著色最重要的因素是類胡蘿卜素［1］，而水產(chǎn)動(dòng)物自身無(wú)法合成類胡蘿卜素，只能從飼料中獲取［2］。

螺旋藻Spirulina被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物的飼料中或作為飼料添加劑［3－4］。螺旋藻含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素和微量元素［5－6］，具有促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)、提高免疫力的功能［7－8］。螺旋藻還富含類胡蘿卜素 (包括β－胡蘿卜素、玉米黃素、海膽烯酮等)，而錦鯉等大多數(shù)淡水魚(yú)可將玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)變成蝦青素 (astaxanthin)，貯存于體內(nèi)用于著色，同時(shí)，其富含的β－胡蘿卜素還能提高魚(yú)體的著色效果。所以，在飼料中添加螺旋藻能有效改善魚(yú)類的體色［3］。此外，螺旋藻中還含有魚(yú)體本身所需的代謝酶，可以提高魚(yú)類對(duì)餌料的利用率，改善其肉質(zhì)［9］。

類胡蘿卜素是脂溶性色素，在動(dòng)物體內(nèi)必須以脂類為載體進(jìn)行運(yùn)輸和吸收利用。因此，飼料中脂類的含量會(huì)影響色素物質(zhì)在魚(yú)體組織和細(xì)胞中的沉積量。已有學(xué)者報(bào)道，飼料脂肪水平會(huì)影響虹鱒對(duì)類胡蘿卜素的吸收利用率，從而影響其體色［10－11］。本試驗(yàn)中，作者在螺旋藻添加量一定的情況下，研究了不同脂肪水平飼料對(duì)錦鯉體色、生長(zhǎng)以及免疫力的影響，旨在為確定錦鯉飼料中脂肪的適宜添加量提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用錦鯉初始體質(zhì)量為 (5.85±0.19)g，由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所小湯山良種繁育中心提供。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后先暫養(yǎng)馴化2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料，待其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開(kāi)始正式試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共分6組，分別記為ZL1、ZL2、ZL3、ZL4、ZL5和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)在200 L的藍(lán)色水槽中進(jìn)行，每槽放魚(yú)10尾，每日投喂2次 (7:00，16:00)，采用表觀飽食投喂。每日換水1次，換水量為總水量的1/3，換水時(shí)吸底并收集糞便。試驗(yàn)用水為曝氣24 h以上的自來(lái)水，水溫為15～25℃，24 h充氣。試驗(yàn)周期為60 d。

1.2.2 飼料的制作及飼料成分的測(cè)定 各試驗(yàn)組飼料的配方、營(yíng)養(yǎng)組成及類胡蘿卜素含量見(jiàn)表1。飼料原料經(jīng)混合后用制粒機(jī)擠壓成硬顆粒飼料，每組飼料制成兩種規(guī)格，直徑分別為1.8、2.5 mm，在烘箱中 (40℃)烘干2 h，至飼料水分含量為8%～9%。保存于冰箱 (－20℃)中?；旌暇S生素與混合礦物質(zhì)均購(gòu)于北京桑普有限責(zé)任公司，螺旋藻為金海岸水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)研發(fā)室產(chǎn)品。采用GB/T6435－1986中的方法測(cè)定飼料中的水分含量，采用GB/T6432－1994中的方法測(cè)定粗蛋白含量，采用GB/T6433－1994中的方法測(cè)定粗脂肪含量，采用GB/T6438－1992中的方法測(cè)定粗灰分含量。

表1 試驗(yàn)飼料配方和組成 (干重)Tab.1 Ingredients and approximate composition of the experimental diets(dry)

1.2.3 魚(yú)體色素的提取和測(cè)定

1)錦鯉體表紅質(zhì) L*、a*、b*值的測(cè)定Robinson［12］以 L*(明度)、a*(a*代表偏紅，－a*代表偏綠)、b*的值 (b*代表偏黃，－b*代表偏藍(lán))來(lái)代表顏色的狀態(tài)。本試驗(yàn)中采用測(cè)色色差計(jì) (GEB－104 Pantone Color－Cue)測(cè)定各組試驗(yàn)魚(yú)體表的L*、a*、b*值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以檢驗(yàn)飼料脂肪水平對(duì)其體色的影響。測(cè)定各組中每尾試驗(yàn)魚(yú)體表L*、a*、b*值時(shí)，先用吸水紙將魚(yú)體表面的水分吸干，再將色差計(jì)的探頭緊貼于試驗(yàn)魚(yú)體表紅斑處，并記錄結(jié)果［13］。

2)總類胡蘿卜素含量的測(cè)定 參考陳曉明等［14］的方法并略作修改。用電子分析天平 (Sartorius BS210，德國(guó))準(zhǔn)確稱取鮮樣樣品0.1 g，剪碎后，用丙酮定容至5 mL，放入超聲波清洗機(jī)中在低溫下用超聲波震蕩40 min后取出，以4000 r/min離心10 min，放入冰箱 (4℃)中靜置24 h。將所得的魚(yú)皮、血清、肝胰臟的色素萃取液分別置于1 cm具蓋的比色皿中，以丙酮為空白對(duì)照管，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) (754型，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn))在200～800 nm下進(jìn)行掃描，找出最大吸收峰所處的波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下測(cè)定各組色素萃取液的吸光度值。

式中:A為吸光度值;K為常數(shù) (104);V為提取液體積 (mL);E為摩爾消光系數(shù) (2500);G為樣品質(zhì)量 (g)。

1.2.4 免疫指標(biāo)的測(cè)定 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每槽隨機(jī)取魚(yú)3尾，于尾靜脈處取血，4℃下以4000 r/min離心10 min收集血清，用于測(cè)定血清中的溶菌酶活力。解剖魚(yú)體，取其腸和肝胰臟，剪碎，按質(zhì)量體積比為1∶9加入預(yù)冷純水，勻漿，制成10%勻漿液，以5000 r/min在4℃下離心10 min，取上清液用于測(cè)定堿性磷酸酶 (AKP)、過(guò)氧化氫酶(CAT)。再用去離子水將上清液稀釋10倍制成1%的勻漿液，用于測(cè)定考馬斯亮藍(lán)蛋白、乳酸脫氫酶 (LDH)、超氧化物歧化酶 (SOD)。按照南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒方法測(cè)定AKP、LDH、SOD，CAT活力 (754型紫外分光光度計(jì))和血清溶菌酶 (LZM)的活力 (酶標(biāo)儀)，用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒 (考馬斯亮蘭法)測(cè)定組織勻漿中的蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±S.D.)表示。采用SPSS 16.0進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，用單因素方差分析作顯著性檢驗(yàn)，用Duncan法進(jìn)一步做組間多重比較。

2 結(jié)果

2.1 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉體色的影響

2.1.1 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉體表紅質(zhì)L*、a*、b*值的影響 由表2可知，各試驗(yàn)組間錦鯉體表紅質(zhì)a*值間雖然沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)，但隨脂肪添加比例的升高，a*值呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，且ZL3組值最大。

飼料中脂肪添加比例對(duì)試驗(yàn)魚(yú)體表紅質(zhì)的L*值也沒(méi)有顯著影響 (P＞0.05);而脂肪水平對(duì)試驗(yàn)魚(yú)體表紅質(zhì)的b*值有一定影響，即隨脂肪添加比例的升高先下降再升高，且當(dāng)脂肪添加比例為10.52% (ZL3組)時(shí)，試驗(yàn)魚(yú) b*值顯著低于ZL2、ZL4、ZL5組 (P＜0.05)。

表2 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉體表L*、a*、b*值的影響Tab.2 Influence of dietary lipid levels on values of L*、a*、b*in ornamental carp body surface

2.1.2 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉各組織中類胡蘿卜素含量的影響 從表3可見(jiàn):飼料脂肪水平對(duì)錦鯉皮膚中類胡蘿卜素含量有一定的影響，即隨著脂肪添加比例的升高，類胡蘿卜素含量先升高再下降，當(dāng)脂肪添加比例為10.52%(ZL3組)時(shí)，皮膚中類胡蘿卜素含量達(dá)到最大，并且顯著高于其它試驗(yàn)組(P＜0.05);而飼料脂肪水平對(duì)錦鯉肝胰臟、血清中的類胡蘿卜素含量沒(méi)有顯著影響 (P＞0.05)。錦鯉皮膚中的類胡蘿卜素含量較肝胰臟、血清中的含量高得多。

表3 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉皮膚、肝胰臟和血清中類胡蘿卜素含量的影響Tab.3 Influence of dietary lipid levels on total cartenoids contents in skin，hepatopancreas and serum of the ornamental carp mg/kg

2.2 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉免疫指標(biāo)的影響

從表4可見(jiàn):飼料脂肪水平的變化對(duì)AKP、LDH、CAT、LZM活力沒(méi)有顯著影響 (P＞0.05);但各試驗(yàn)組錦鯉血清中SOD活力卻隨著脂肪添加比例的升高而遞減，ZL5組 (脂肪添加比例為15.45%)SOD活力顯著低于 ZL1組 (P＜0.05)，其余組間差異不顯著 (P＞0.05)。

表4 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉各項(xiàng)免疫指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of dietary lipid levels on the immune parameters in the ornamental carp

3 討論

3.1 飼料脂肪水平與錦鯉體色的關(guān)系

螺旋藻中富含玉米黃質(zhì)和β－胡蘿卜素，而錦鯉等大部分淡水魚(yú)可將黃體素、玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素［1］，且β－胡蘿卜素能提高發(fā)色效果，故螺旋藻能使魚(yú)體增色。何培民［15］的試驗(yàn)表明，在配合飼料中添加富含β－胡蘿卜素的螺旋藻粉，隨著其含量的添加，錦鯉的體色變得更加艷麗。Okada等［16］用添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和10%的螺旋藻粉的飼料喂養(yǎng)黃帶鲹Caranx delicatissimus 83 d后，投喂含螺旋藻粉的試驗(yàn)魚(yú)皮膚色素含量顯著高于投喂沙丁魚(yú)的對(duì)照組，且外觀明亮帶綠，黃帶鮮明，體色有明顯改善。

在用測(cè)色色差計(jì)測(cè)定的指標(biāo)中，a*值越大，說(shuō)明紅色斑塊越紅;L*值越大，說(shuō)明亮度越高，顏色越鮮亮。本試驗(yàn)結(jié)果表明:錦鯉體表紅質(zhì)a*值隨脂肪添加比例的升高呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)脂肪添加比例為10.52%(ZL3組)時(shí)，錦鯉體表紅質(zhì)的紅度即a*值最高 (P＜0.05)。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):隨著飼料中脂肪添加比例的升高，錦鯉皮膚中類胡蘿卜素的含量呈現(xiàn)出與a*值相同的變化趨勢(shì)，脂肪添加比例為5.36%～10.52%時(shí)，皮膚中類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，說(shuō)明脂肪對(duì)魚(yú)體成色具有一定的促進(jìn)作用。Nickell等［17］用含不同脂肪水平的飼料飼喂虹鱒時(shí)，結(jié)果與本試驗(yàn)相類似。研究表明:隨著脂肪添加比例的升高，蝦青素的著色程度和著色效率均有所升高。如Storebakken等［18］的研究表明，血清中蝦青素含量的高低直接反映出魚(yú)類對(duì)蝦青素的吸收利用程度;Barbosa等［19］的試驗(yàn)結(jié)果也表明，飼喂含較高脂肪含量的蝦青素飼料后，虹鱒血清中蝦青素的濃度較高。

韓學(xué)哲［20］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)油脂添加的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～20%時(shí)，蝦青素對(duì)紅劍尾魚(yú)的著色效果先增加后降低，其中油脂添加量為20%時(shí)著色效果最差。Bjarne等［21］在對(duì)北極紅點(diǎn)鮭 Salvelinus alpinus的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，皮膚和肌肉中類胡蘿卜素的含量隨著試驗(yàn)時(shí)間的增長(zhǎng)而升高，但蝦青素的添加量只在試驗(yàn)初期對(duì)類胡蘿卜素的積累影響顯著。魚(yú)類的體色并非始終隨飼料中色素添加量的增加而加深，如果色素添加量超過(guò)一定限度，魚(yú)體中沉淀的色素量會(huì)隨其飼料中色素添加量的增加而下降。本試驗(yàn)中也出現(xiàn)過(guò)類似的情況，即當(dāng)脂肪添加比例超過(guò)10.52%時(shí)，錦鯉皮膚中類胡蘿卜素含量顯著下降(P＜0.05)，說(shuō)明脂肪對(duì)魚(yú)體成色的促進(jìn)作用并不是隨脂肪添加比例的升高而無(wú)限增強(qiáng)。其原因可能是，魚(yú)體沉積色素的能力具有一定限度，當(dāng)飼料脂肪添加比例為10.52%時(shí)，魚(yú)體沉積的色素量已經(jīng)飽和，超過(guò)這個(gè)飽和度會(huì)導(dǎo)致一部分色素不能沉積在魚(yú)體內(nèi)，而是隨著代謝將一部分色素排出體外，進(jìn)而魚(yú)體內(nèi)色素含量下降。

Hardy等［22］的研究表明，魚(yú)類通過(guò)消化系統(tǒng)吸收類胡蘿卜素后，主要沉積于皮膚、肌肉、肝臟和腎臟中，在吸收代謝過(guò)程中，膽汁和血漿作用顯著。March等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在餌料中添加40、70、100 mg/kg蝦青素時(shí)，虹鱒Oncorhynchus mykiss和大西洋鮭Salmo salar體末端著色最深，前端漸淺;而大鱗大馬哈魚(yú)O.tschawytscha中部著色最深，其次是前端和尾部。Metusalach等［24］用含65 mg/kg角黃素的餌料飼喂體質(zhì)量為150 g的北極紅點(diǎn)鮭Salvelinus alpinus幼鮭，24周后沉積類胡蘿卜素的主要組織為肌肉，其次是皮膚、肝胰臟和性腺。本試驗(yàn)中，隨著脂肪添加比例的升高，試驗(yàn)魚(yú)肝胰臟、血清中的色素含量均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，但各試驗(yàn)組之間差異不顯著 (P＞0.05)。與此同時(shí)，相對(duì)于皮膚來(lái)講，肝胰臟、血清中的色素含量要少得多。由此推測(cè)，皮膚是錦鯉色素沉積的主要部位。這與張曉紅等［25］用蝦青素飼料飼喂血鸚鵡得出的結(jié)論相一致。

3.2 飼料脂肪水平對(duì)錦鯉免疫指標(biāo)的影響

螺旋藻含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、葉綠素、β－胡蘿卜素及多糖類物質(zhì)，多糖中的藻多糖和藻藍(lán)蛋白均能增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)胸腺、脾臟等免疫器官的生長(zhǎng)和促進(jìn)血清蛋白的生物合成，因此螺旋藻具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用［9］。機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵性的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)等。其中 SOD可催化 O－2生成 H2O2，從而清除O－2，而CAT能催化H2O2生成水和氧氣，因此，SOD和CAT可作為機(jī)體非特異性免疫指標(biāo)，來(lái)評(píng)判免疫刺激劑對(duì)機(jī)體非特異性免疫力的影響。本研究結(jié)果表明，在飼料中添加螺旋藻后，試驗(yàn)魚(yú)肝胰臟中的SOD活性降低。其原因可能是螺旋藻在試驗(yàn)魚(yú)機(jī)體內(nèi)也能很好地發(fā)揮抗氧化作用，使自由基在尚未發(fā)揮作用前就被清除了，導(dǎo)致誘導(dǎo)性酶活性降低，從而維持動(dòng)物體自身自由基的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)中，飼料脂肪水平的變化沒(méi)有對(duì)試驗(yàn)魚(yú)堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、血清溶菌酶活力產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05)。

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