胡彩虹 朱 康 錢(qián)仲倉(cāng) 欒兆雙 李衛(wèi)芬

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，飼料科學(xué)研究所，杭州 310058)

仔豬斷奶應(yīng)激綜合征是養(yǎng)豬生產(chǎn)的世界性難題，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。斷奶應(yīng)激狀態(tài)下仔豬腸形態(tài)和腸黏膜屏障受損是造成仔豬斷奶應(yīng)激綜合征的主要原因［1］。丁酸是腸上皮細(xì)胞的首要能量來(lái)源，研究表明飼糧中添加丁酸鈉可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖和發(fā)育，有效保護(hù)腸黏膜屏障［2］。但是，由于大量丁酸鈉在腸道前段被分解吸收，難以到達(dá)腸道后段，這大大降低了其腸道保護(hù)功效［3］。如何控釋丁酸使其能在腸道各段均勻釋放，尤其是能保護(hù)后段腸道成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［4］。

為了解決丁酸鈉(有效成分為丁酸)在腸道前段被分解吸收不能達(dá)到后段腸道的問(wèn)題，目前主要采用包膜技術(shù)對(duì)丁酸鈉進(jìn)行控釋?zhuān)@種方法工藝復(fù)雜，成本高昂［3-4］。而硅膠價(jià)格低廉，具有物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積大、吸附性能高、可形成不同的微孔結(jié)構(gòu)、生物相容性及吸附脫附性能較好等優(yōu)點(diǎn)［5］，在藥物、酶、生長(zhǎng)因子等控緩釋上已有大量應(yīng)用和研究［6-7］。因此，本試驗(yàn)以硅膠為控釋載體，制備和表征了硅膠控釋型丁酸(silica gel controlled-release butyrate，SG-B)，并以丁酸鈉為對(duì)照，研究SG-B對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和腸黏膜屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粗孔硅膠(青島海洋化工廠，分析純);正丁酸(CH3CH2CH2COOH)(雙香助劑廠，分析純)。

1.2 SG-B的制備及表征

采用室溫過(guò)量浸漬法制備SG-B。將硅膠置于120℃恒溫干燥箱中，干燥6 h，至恒重。將干燥后的硅膠和正丁酸溶液按照固液比1 g∶1 mL于室溫下充分混合，并連續(xù)攪拌至吸附平衡。再將已吸附飽和的硅膠過(guò)濾，置于50℃恒溫干燥箱中，干燥20 min。

紅外光譜采用KBr壓片法，Nexus-670型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀(美國(guó)Nicolet公司)表征SG-B紅外吸收特征，掃描范圍400～4 000 cm-1。ZRY-2P型綜合熱分析儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)對(duì)SG-B進(jìn)行熱重分析(TG)，升溫速度為10℃/min。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

選用平均體重為(5.8±0.2)kg的54頭21日齡“杜×長(zhǎng)×大”斷奶仔豬，按胎次一致、體重相近的原則隨機(jī)分為3組:1)對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧;2)丁酸鈉組，飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.10%丁酸鈉(丁酸含量為0.078%);3)SG-B組，飼喂基礎(chǔ)飼糧 +0.19%SG-B(丁酸含量為0.078%)，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭仔豬，公母各占1/2。試驗(yàn)期為10 d。

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1998)斷奶仔豬的營(yíng)養(yǎng)需要量配制成顆粒料，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開(kāi)始前，仔豬自由吮乳和飲水，按常規(guī)程序進(jìn)行免疫，從7日齡開(kāi)始誘食并哺乳至21日齡斷奶。試驗(yàn)過(guò)程中，仔豬自由采食和飲水，其余飼養(yǎng)管理均按養(yǎng)殖場(chǎng)的常規(guī)方案進(jìn)行。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，記錄試豬空腹重;試驗(yàn)期內(nèi)，每天記錄并統(tǒng)計(jì)采食量和腹瀉情況;試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試豬空腹稱(chēng)重。分別計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹瀉率。腹瀉率按如下公式計(jì)算:

腹瀉率(%)=［(腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù))/

(試驗(yàn)總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))］×100。

1.5.2 腸屏障通透性及腸道黏膜形態(tài)的分析

在斷奶后第10天，禁食12 h(自由飲水)，從每個(gè)重復(fù)中選取2頭試豬(公母各占1/2)，稱(chēng)重后肌肉注射4%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg體重)進(jìn)行麻醉。待麻醉完全后前腔靜脈取血，肝素抗凝，3 000 r/min離心后制備血漿，-70℃保存。參考胡彩虹等［8］分光光度法測(cè)定血漿D-乳酸濃度和二胺氧化酶(DAO)活性，分析腸屏障通透性。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

試豬采血后屠宰，取十二指腸，空腸和回腸腸段進(jìn)行腸道黏膜形態(tài)分析。采用RM2235型組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)整套設(shè)備，將腸段樣品經(jīng)固定、修整、沖洗、脫水、切片(厚度約5 μm)和蘇木精-伊紅(HE)染色制成切片。每個(gè)樣品制作3個(gè)非連續(xù)性的縱切片和橫切片，每張縱切片測(cè)定10個(gè)絨毛高度和隱窩深度，取其平均值作為一個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)。利用Leica Qwin圖像分析儀(德國(guó)Leica公司)對(duì)絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度與隱窩深度比值進(jìn)行顯微測(cè)量和分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模式(GLM)進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較和顯著性分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 SG-B傅里葉變換紅外光譜分析

從圖1中可以看出，硅膠吸附丁酸前，3 459 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于SiO—H鍵和物理吸附水中HO—H鍵的伸縮振動(dòng);1 633 cm-1處是表面吸附水的吸收峰［9］;1 097、798 和 466 cm-1處的吸收峰分別代表Si—O—Si鍵的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)、對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰［10］。硅膠吸附丁酸后，在1 717和2 973 cm-1處出現(xiàn)了2個(gè)吸收峰，分別歸因于羰基的伸縮振動(dòng)和飽和的C—H鍵伸縮振動(dòng)［11］，說(shuō)明有丁酸吸附于硅膠。

圖1 硅膠吸附丁酸前后的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.1 FT-IR image of silica gel and SG-B

2.2 SG-B 熱重分析

從圖2中可以看出，樣品在120℃以下均有一個(gè)明顯的質(zhì)量損失階段，吸附丁酸后的硅膠質(zhì)量明顯減少。這一階段的質(zhì)量損失為樣品吸附的丁酸脫附引起的，說(shuō)明脫附前硅膠中存在大量的吸附丁酸。熱重分析表明，SG-B中丁酸的含量為41.1%。同時(shí)也說(shuō)明有機(jī)基團(tuán)被引入，這與傅里葉變換紅外光譜的分析結(jié)果相一致，推測(cè)丁酸負(fù)載在硅膠上，以表面吸附和形成氫鍵的形式存在［12］。硅膠本身的結(jié)構(gòu)和吸附后新鍵的產(chǎn)生保證了丁酸的控釋效果。

圖2 硅膠吸附丁酸前后的熱重分析圖Fig.2 TG image of silica gel and SG-B

2.3 SG-B對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，和對(duì)照組相比，SG-B組和丁酸鈉組平均日增重分別顯著提高了12.30%(P＜0.05)和14.60%(P ＜0.05)。平均日采食量 3 組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。SG-B組和丁酸鈉組料重比分別比對(duì)照組顯著降低了10.83%(P＜0.05)和9.55%(P ＜0.05)。丁酸鈉和SG-B 的添加降低了腹瀉率，分別比對(duì)照組顯著降低了36.97%(P ＜0.05)和 46.17%(P ＜0.05)。

表2 控釋型丁酸對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of SG-B on growth performance in weaned piglets

2.4 SG-B對(duì)斷奶仔豬腸屏障通透性的影響

由表3可知，和對(duì)照組相比，SG-B組和丁酸鈉組血漿D-乳酸濃度分別顯著降低了31.01%(P ＜0.05)和 23.61%(P ＜0.05);二胺氧化酶活性分別顯著降低了34.18%(P ＜0.05)和29.10%(P＜0.05)。SG-B組和丁酸鈉組間2個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。

表3 SG-B對(duì)斷奶仔豬腸屏障通透性的影響Table 3 Effects of SG-B on intestinal barrier permeability in weaned piglets

2.5 SG-B對(duì)斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)的影響

由表4可知，丁酸鈉組和SG-B組的十二指腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度比值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，隱窩深度顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。丁酸鈉組空腸絨毛高度高于對(duì)照組，但差異不顯著(P＞0.05);SG-B組絨毛高度顯著高于丁酸鈉組和對(duì)照組(P＜0.05)。丁酸鈉組回腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度比值均高于對(duì)照組，但差異不顯著(P＞0.05);SG-B組絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度比值均顯著高于對(duì)照組和丁酸鈉組(P＜0.05)，隱窩深度顯著低于對(duì)照組和丁酸鈉組(P ＜0.05)。

表4 SG-B對(duì)斷奶仔豬腸黏膜形態(tài)的影響Table 4 Effects of SG-B on intestinal mucosal morphology in weaned piglets

3 討論

硅膠是由硅酸凝膠mSiO2·nH2O適當(dāng)脫水而成的顆粒大小不同的多孔物質(zhì)，具有開(kāi)放的多孔結(jié)構(gòu)，比表面積大，能吸附許多物質(zhì)，常作為干燥劑、吸附劑和催化劑載體。由于具有良好的生物相容性，硅膠或者改性硅膠作為載體廣泛應(yīng)用于催化和藥物控緩釋領(lǐng)域［13］。Radin等［14］利用硅膠作為載體控釋萬(wàn)古霉素，發(fā)現(xiàn)硅膠作為藥物載體無(wú)生物毒性，且脫附效果良好，6周累積脫附率為90%。陳禹銀等［15］研究了硅膠吸附丁酸的計(jì)量置換吸附模型，發(fā)現(xiàn)丁酸在硅膠上的吸附是自發(fā)的過(guò)程，隨著溫度的升高，吸附量減少。本研究發(fā)現(xiàn)，在常溫下，粗孔硅膠對(duì)丁酸的負(fù)載量為41.1%，和陳禹銀等［15］的研究結(jié)果基本一致。

D-乳酸是胃腸道內(nèi)固有菌，如大腸桿菌、乳酸桿菌等代謝、裂解的產(chǎn)物。當(dāng)腸黏膜屏障受損時(shí)，D-乳酸即可透過(guò)腸黏膜進(jìn)入血液中，使得血漿D-乳酸濃度升高。二胺氧化酶是小腸黏膜上皮細(xì)胞漿內(nèi)具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。斷奶應(yīng)激后，細(xì)胞受到損傷，胞內(nèi)釋放二胺氧化酶增加，進(jìn)入腸細(xì)胞間隙、淋巴管和血液，使得血漿二胺氧化酶活性升高［8］。丁酸能夠?yàn)槟c上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸黏膜的發(fā)育和修復(fù)，增加腸道淋巴細(xì)胞數(shù)量。有大量研究表明，飼糧中添加丁酸鈉可有效保護(hù)斷奶仔豬腸黏膜屏障［16-17］。本試驗(yàn)中，SG-B組和丁酸鈉組的血漿D-乳酸濃度和二胺氧化酶活性較對(duì)照組均有顯著降低，SG-B組和丁酸鈉組相比，血漿D-乳酸濃度和二胺氧化酶活性無(wú)顯著差異，說(shuō)明飼糧中添加丁酸鈉和SG-B能保護(hù)腸黏膜屏障，添加0.10%丁酸鈉和添加0.19%SG-B對(duì)腸黏膜保護(hù)作用相當(dāng)。

小腸的絨毛高度和隱窩深度是衡量腸道健康的重要指標(biāo)［18］。丁酸是腸道絨毛生長(zhǎng)主要的能量來(lái)源，可在腸上皮細(xì)胞內(nèi)直接氧化供能［19］。丁酸能促進(jìn)干細(xì)胞增殖，通過(guò)增加小腸絨毛高度和降低隱窩深度而擴(kuò)大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的表面積，尤其是在回腸近端與遠(yuǎn)端［20］。Hu 等［21］試驗(yàn)表明，丁酸鈉增加了雞空腸后段絨毛高度與隱窩深度比值，對(duì)十二指腸黏膜的RNA、DNA和蛋白質(zhì)有影響，而對(duì)回腸黏膜的RNA、DNA和蛋白質(zhì)沒(méi)有影響。出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于丁酸鈉在進(jìn)入回腸前大部分已被吸收利用或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)(如乙酸)被吸收。而SG-B進(jìn)入胃腸道后，丁酸在小腸的各個(gè)腸段是均勻釋放的。和普通丁酸鈉相比，SG-B通過(guò)對(duì)丁酸的控緩釋實(shí)現(xiàn)了對(duì)后段腸段(空腸和回腸)消化吸收功能的增強(qiáng)。沈建明等［22］研究了包被技術(shù)處理的丁酸鈉對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響，和普通丁酸鈉組相比，包膜丁酸鈉顯著提高了仔豬的生長(zhǎng)性能，改善了腸黏膜形態(tài)，提高了飼料利用率，這和本研究結(jié)果一致。后段腸段是丁酸發(fā)揮其功效的主要部位，硅膠具有良好的吸附和脫附性能，通過(guò)硅膠對(duì)丁酸的控釋作用解決了普通丁酸鈉(有效成分為丁酸)不能到達(dá)動(dòng)物后段腸段的問(wèn)題，這是SG-B顯著改善空腸和回腸腸黏膜形態(tài)，保護(hù)腸道功能的主要原因。

4 結(jié)論

①采用室溫過(guò)量浸漬法制備和表征了SG-B，熱重分析表明其丁酸負(fù)載量為41.1%。

② 添加0.19%SG-B降低了斷奶仔豬腹瀉率，提高了生長(zhǎng)性能，改善了腸黏膜形態(tài)，且效果略?xún)?yōu)于同劑量(丁酸根含量)的丁酸鈉，可見(jiàn)SG-B是一種優(yōu)良的仔豬腸道保護(hù)劑。

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