李祥翠 張奕 李吉平 王家東

·研究報告·

分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中上皮鈉通道
mRNA的表達及其意義*

李祥翠1張奕1李吉平1王家東1

目的 探討上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）m RNA在分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中的表達及其意義。方法 12只SD大鼠實驗耳經(jīng)鼓膜注入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制造分泌性中耳炎（otitis media with effusion，OME）動物模型，在造模后第二天取中耳黏膜，采用實時定量－聚合酶鏈反應（real time－polymerase chain reaction，Red time PCR）檢測中耳黏膜中ENaC－mRNA的表達，并與對照耳（注入等量生理鹽水）相比較。結(jié)果 實驗耳α－、β－、γ－ENaC－m RNA的相對表達量分別為0.007 8、0.009 2、0.007 6，對照耳α－、β－、γ－ENaC－m RNA的相對表達量分別為0.012 1、0.012 6、0.011 7；實驗耳相α－、β－、γ－ENaC－mRNA相對于對照組分別下調(diào)1.56倍（P＜0.05）、1.37倍（P＜0.05）、1.53倍（P＜0.01）。結(jié)論 ENaC在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜中基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)，這可能是導致OME早期積液形成的機制之一。

中耳炎，分泌性； 上皮鈉通道； 實時定量－聚合酶鏈反應

維持中耳腔的相對干燥狀態(tài)從而保證聲波從鼓膜正常地傳導至內(nèi)耳是中耳黏膜的基本生理功能之一。中耳黏膜和呼吸道黏膜具有同源性，即中耳黏膜表面亦覆蓋著氣道表面液體（airway surface liquid，ASL），其電解質(zhì)、水分的成分及量的相對恒定在維持中耳黏膜的相對干燥狀態(tài)中起著重要作用［1］。研究表明，上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）通過對離子和水的轉(zhuǎn)運，在維持肺泡腔的液體平衡中起著重要作用，并能夠?qū)Ψ闻葜蟹e液進行快速清除［2］。有研究表明中耳黏膜上皮同樣具有ENaC介導的液體吸收功能［1］。為了觀察分泌性中耳炎狀態(tài)下中耳黏膜ENaC的變化，本研究采用實時定量－聚合酶鏈反應（real time－polymerase chain reaction，Red time PCR）技術(shù)從基因轉(zhuǎn)錄水平檢測了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的大鼠OME模型中耳黏膜中ENaC－mRNA表達情況，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及造模［3］清潔級健康SD雄性大鼠12只（24耳），鼠齡5～7周，體重140～250克，無噪聲暴露和耳毒性藥物使用史，耳廓反射靈敏，解剖顯微鏡下外耳道、鼓膜均無異常，術(shù)前ABR、聲導抗檢測結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。大鼠苯巴比妥鈉（70 mg／kg）腹腔注射后，安爾碘消毒外耳道，采用微量注射器將200μg／ml的LPS 25μl經(jīng)鼓膜前下方注入試驗耳，對照耳注入等量的生理鹽水。實驗動物統(tǒng)一編號，統(tǒng)一進行飼養(yǎng)和實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取 在動物造模后第二天于苯巴比妥鈉（70 mg／kg）腹腔注射麻醉后，快速斷頭處死，取出聽泡用去RNA酶處理的器械打開聽泡，在解剖顯微鏡下剝離中耳腔鼓岬、中下鼓室及咽鼓管周圍的黏膜，立即放入去RNA酶處理的離心管中，液氮保存，由于大鼠中耳黏膜量極少，故將每兩只動物的中耳黏膜標本合并為一份實驗樣品，共6份樣品。應用Trizol法抽提總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA 取5μg總RNA＋1μl寡居脫氧核苷酸［Oligo（d T）20］＋1μl d NTP（10 mol／ml），用焦碳酸二乙酯水補足至總體積10μl；65℃變性5 min，立即置于冰上至少1 min；加入10μl合成互補DNA反應混合液，該混合液（2μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4μl MgCl2（25 mol／L）、2 μl DTT（0.1 mol／L）、1μl RNaseOUTTM（40 U／μl）、1μl Superscript TMⅢRT（200 U／μl）），50℃50 min互補DNA合成；85℃50 min終止反應；加入1μl E.coliRNA酶H（2 U／μl），37℃20 min酶解殘留的RNA；－20℃保存。

1.2.3 Real time PCR反應 ①引物設計如下：α－ENaC（174 bp），正向引物：5′CAGTTCGCCTTGCTGTTCG3′，反向引物：5′AAGCGTCTGCTCCGTGAGT3′；β－ENaC（724 bp），正向引物：5′CAACACGACCTATTCCATCC3′，反向引物：5′AGCCTCAGGGAGTCATATG3′；γ－ENaC（286 bp），正向引物：5′ACAAAGACCTGAACCAAAG3′，反向引物5′GCATAGCAGAGGTAAAAGT3′；β－actin（211 bp，內(nèi)參照），正向引物：5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，反向引物：5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′。②PCR反應體系：取100 ng模板互補DNA＋10μl 2×QuantiFast SYBRGREEN PCR Master Mix＋1μl正向引物（10μmol）＋1μl反向引物（10μmol），用不含RNA酶的水補足至總體積20 μl；每個樣本互補DNA的每個基因做3個復孔。③95℃變性3 min；40個PCR循環(huán)（94℃，20秒；59℃，20秒；72℃，30秒）；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。④將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋設定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10－1、1×10－2、1 ×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8、1× 10－9這幾個濃度的DNA；將這幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有的cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應體系，置于Realtime PCR反應儀進行PCR反應。基因?qū)崟r定量PCR反應條件：95℃，5 min；40個PCR循環(huán)［（95℃，10秒；59℃，15秒；72℃，20秒；82.5℃（收集熒光），5秒］。擴增反應結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢升溫至99℃（每5秒升高1℃），建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，以鑒定產(chǎn)物是否單一。繪制標準曲線，通過7 300 System Software軟件的分析，計算出樣本中各基因的循環(huán)閾值（CT值）。CT值經(jīng)對數(shù)擬合作圖，得到定量標準曲線。根據(jù)E＝10（－1／slope）計算擴增效率，采用管家基因β－actin（不同樣品間的表達量基本恒定）作為內(nèi)參來校正，待測樣品基因相對含量＝2－△CT（△CT＝待測基因CT－管家基因CT）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

造模后4～6小時解剖顯微鏡觀察所有大鼠的實驗耳鼓膜渾濁，造模后第二天12只大鼠實驗耳均現(xiàn)中耳積液，對照耳鼓膜透明，即12只試驗耳均造模成功。大鼠實驗耳中耳腔黏膜α－、β－、γ－ENaC－m RNA的轉(zhuǎn)錄相對于對照耳分別下調(diào)1.56倍、1.37倍和1.53倍（表1）。

表1 大鼠中耳黏膜上皮鈉通道m(xù)RNA相對表達量（ˉx±s）

3 討論

上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）介導的液體吸收在各種組織的鈉、水平衡中起著重要的作用，已有研究表明ENaC分布在各級呼吸道（從鼻咽到細支氣管）上皮細胞的腔頂面［4］，對維持氣道黏膜ASL的穩(wěn)定性起著重要作用［5］。Choi等［6］采用改良的Ussing室宏觀電生理測量方法研究發(fā)現(xiàn)中耳黏膜上皮細胞ENaC介導的amiloride敏感的的短路循環(huán)電流（amiloride－sensitive Isc）顯著高于鼻黏膜上皮細胞，由于ENaC介導的Isc反應細胞對Na＋的吸收能力，故ENaC在中耳黏膜上皮細胞的離子轉(zhuǎn)運較鼻黏膜上皮細胞大，這可能與人中耳黏膜上皮細胞要保持中耳腔的相對干燥狀態(tài)有關(guān)；通過Western blot檢測對比兩種組織中的ENaC三個亞基的表達發(fā)現(xiàn)，中耳黏膜組中的ENaC蛋白表達顯著高于鼻黏膜組；該研究進一步通過比較兩者的amiloride敏感液體吸收率發(fā)現(xiàn)，中耳黏膜的液體吸收率顯著快于鼻黏膜，進一步從功能上證實ENaC在中耳黏膜上皮細胞離子轉(zhuǎn)運中的作用的重要性，在維持中耳腔黏膜的較薄的ASL的穩(wěn)定性中起著重要作用。另有研究［7～9］也表明體外培養(yǎng)的中耳黏膜上皮細胞也有ENaC表達且在積液吸收中起著主導作用。近年來，本課題組［10，11］報道了健康大鼠的中耳黏膜具有ENaC介導的鈉、水轉(zhuǎn)運功能，進一步在活體中證實了ENaC介導的液體吸收在中耳生理學中的作用。

以上研究均是在正常情況下研究ENaC在中耳黏膜上皮細胞離子轉(zhuǎn)運中的作用，那么在病理狀態(tài)下（如OME）下，ENaC是否也發(fā)揮著同樣的作用呢？本研究通過實時定量PCR對比研究OME模型豚鼠實驗耳與對照耳ENaC－m RNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)與對照耳相比，實驗耳α－、β－、γ－ENaC－mRNA的轉(zhuǎn)錄均顯著下調(diào)，即在炎癥早期，ENaC在中耳黏膜的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這與Choi等［7］的研究結(jié)果相對一致。因為IL－1β是重要的早期炎癥反應因子之一且在OME中表達上升［12］，通過對比IL－1β處理組（10 ng／ml培養(yǎng)液中處理24小時）與正常組的人中耳黏膜上皮細胞的ENaC的mRNA轉(zhuǎn)錄及amiloride敏感的的Isc發(fā)現(xiàn)：IL－1β處理后ENaC介導的Isc從14.2±1.3μA／cm2降至10.3± 1.4μA／cm2（P＜0.05），α、β－ENaC－m RNA相對減少16%、41%，而γ－ENaC－mRNA的轉(zhuǎn)錄無明顯變化，由此推斷人中耳黏膜上皮細胞的ENaC在早期炎癥因子（IL－1β）的作用下在基因轉(zhuǎn)錄及功能等方面呈抑制狀態(tài)，使中耳黏膜轉(zhuǎn)運離子功能下降，從而導致中耳積液，這可能是OME早期積液形成的機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)在OME造模成功后第二天（即炎癥早期）中耳黏膜組織ENaC的轉(zhuǎn)錄呈下調(diào)狀態(tài)，那么ENaC在OME的中晚期表達是否亦呈抑制狀態(tài)呢？Song等［13］通過堵塞健康大鼠咽鼓管誘導OME后研究ENaC在病理狀態(tài)下的表達，在咽鼓管堵塞后的第2、4、8周（即炎癥中、晚期）取大鼠實驗耳和對照耳聽泡分別用PCR測定ENaC－m RNA的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)α－ENaC－mRNA在第2、4周的轉(zhuǎn)錄顯著降低，但在第8周卻顯著增加至對照組的1.48倍；β－ENaC－mRNA在第2周時兩組無明顯差異，而在第4、8周時則顯著增加；而γ－ENaC－mRNA在第2、4、8周均呈顯著增加，故推測ENaC的表達可能與中耳黏膜組織暴露于炎癥狀態(tài)的時程有關(guān)，具體機制有待進一步的研究。由于存在m RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制，炎癥早期ENaC的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)是否影響ENaC的蛋白表達及其功能有待進一步的研究?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)經(jīng)鼓膜注入LPS誘導的分泌性中耳炎大鼠模型中，在OME早期ENaC基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，這可能是OME早期積液形成的機制之一，其分子生物學基礎(chǔ)及其調(diào)控機制有待進一步的研究。

1 Portier F，Kania R，Planès C，et al.Enhanced sodium absorption in middle ear epithelial cells cultured at air－liquid interface［J］.Acta.Otolaryngol，2005，125：16.

2 Guidot DM，F(xiàn)olkesson HG，Jain L，et al.Integrating acute lung injury and regulation of alveolar fluid clearance［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，291：L301.

3 Cho JG，Lee ES，Woo JS，et al.Expressions of cyclooxygenase 1 and 2 in endotoxin－induced otitis media with effusion in the rat［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2007，71：101.

4 Rochelle LG，Li DC，Ye H，et al.Distribution of ion transport mRNAs throughout murine nose and lung［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279：14.

5 Song Y，Namkung W，Nielson DW，et al.Airway surface liquid depth measured in ex vivo fragments of pig and human trachea：dependence on Na＋and Cl－channel function［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297：L1 131.

6 Choi JY，Son EJ，Kim JL，et al.ENaC－and CFTR－dependent ion and fluid transport in human middle ear epithelial cells［J］.Hear Res，2006，211：26.

7 Choi JY，Choi YS，Kim SJ，et al.Interleukin－1beta suppresses epithelial sodium channel beta－subunit expression and ENaC－dependent fluid absorption in human middle ear epithelial cells［J］.Eur J Pharmacol，2007，567：19.

8 Son EJ，Kim SH，Park HY，et al.Activation of epithelial sodium channel in human middle ear epithelial cells by dexamethasone［J］.Eur J Pharmacol，2009，602：383. 9 Portier F，Van den Abbeele T，Lecain E，et al.Oxygen modulates Na＋absorption in middle ear epithelium［J］.Am J Physiol，1999，276：C312.

10 Li JP，Kania R，Eric L，et al.In vivo demonstration of the absorptive function of the middle ear epithelium［J］.Hearing Research，2005，210：1.

11 李吉平，金曉杰，王家東，等.鈉離子濃度變化對大鼠中耳液體吸收功能影響的研究［J］.聽力學及言語疾病雜志，2008，16：411.

12 Yellon RF，Leonard G，Marucha PT，et al.Characterization of cytokines present in middle ear effusions［J］.Laryngoscope，1991，101：165.

13 Song JJ，Kown SK，Kim EJ，et al.Mucosal expression of ENaC and AQP in experimental otitis media induced by Eustachian tube obstruction［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2009，73：1 589.

（2011－02－11收稿）

（本文編輯 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.05.020

時間：2011－9－5 14：59

R764.21

A

1006－7299（2011）05－0457－03

* 上海市衛(wèi)生局科研課題計劃（2007Y02）、上海交通大學“醫(yī)工（理）交叉研究基金”項目（YG2010MS28）聯(lián)合資助

1 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科、上海交通大學（醫(yī)學院）耳鼻咽喉科研究所（上海 200127）

李吉平（Email：lijp74＠yahoo.com.cn）

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