詹杰 柳承希 李延龍 魏樹和 張靜生

鎘(Cd)是常見的環(huán)境和工業(yè)毒物，可通過食物、飲水、吸煙等途徑進(jìn)入人體。一般認(rèn)為其生物半衰期長達(dá)10～35年，很少量的鎘進(jìn)入體內(nèi)就可因?yàn)樯镄罘e和生物放大作用對機(jī)體產(chǎn)生一系列的損傷作用，因而鎘被美國毒物管理委員會(ATSDR)列為第六位危機(jī)人體健康的有毒物質(zhì)。近年研究表明，鎘的毒害作用也是引起動脈硬化、高血壓等心腦血管的原因之一，因此研究鎘中毒性動脈硬化致病機(jī)制及防治方法有重要的實(shí)際意義。鋅是人體必需元素，參與酶分子結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、mRNA更新、抗氧化等多種生理功能，缺鋅與血管硬化和心臟病發(fā)生有關(guān)［1］。本文利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECS)體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察鋅對鎘染毒血管內(nèi)皮細(xì)胞的防護(hù)作用與可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。健康Wister大鼠36只(動物合格證號:SCXK(遼)2003-0016)，雄性，體質(zhì)量300 ～350 g。

1.1.2 試劑 DMEM(GIBCO公司);無菌滅活小牛血清(GIBCO公司);NO試劑盒(南京建成生物公司);人sICAM-1ELISA試劑盒、人細(xì)胞色素C ELISA試劑盒(上海瑞齊生物公司);Annexin V/PI凋亡試劑盒(北京寶賽生物公司)。氯化鎘、硫酸鋅等試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀(BID RAD);724型可見光分光光度計(jì)(上海分析儀器);CO2培養(yǎng)箱(THERMO);IX-70熒光倒置顯微鏡(Olympus日本);高速冷凍離心機(jī)(SIGMA);雙人凈化臺(蘇州凈化);流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 共分3組。空白組(normal group，NG):空白血清處理的 HUVECSS細(xì)胞;模型組(Cd):1、5、10、30和60 μm不同濃度鎘(Cdcl2)血清處理的HUVECSS細(xì)胞;補(bǔ)鋅組(Cd+Zn):不同濃度鎘及硫酸鋅血清處理的HUVECS細(xì)胞。

1.2.2 藥物血清制備 按藥物血清制備通法，補(bǔ)鋅組按人的每天等效劑量的10倍硫酸鋅濃度1 mg/ml，2 ml/(次·只)灌胃，正常對照組和模型組以0.9%氯化鈉注射液等量灌胃，1次/d，連續(xù)3 d，末次灌胃給藥1 h后腹主動脈采血，分離血清，-85℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞損傷模型的建立 HUVECS細(xì)胞株，采用2.5 g/L胰酶消化，加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞呈單層鋪路石樣融合狀態(tài)后，再用2.5 g/L胰蛋白酶消化，得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液調(diào)整為5×105/ml，接種于24及96孔板，加入各組藥物血清，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行指標(biāo)測試。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 硝酸還原酶法 測定NO:取細(xì)胞培養(yǎng)液100 μl，于波長550 nm測定吸光度，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量。

1.3.2 ELISA法 采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可溶性細(xì)胞間黏附分子1(sICAM-1)和細(xì)胞色素C(Cyt C)的含量。每組設(shè)3復(fù)孔，分別用酶標(biāo)儀450 nm波長下測定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中sICAM-1和Cyt C的含量。

1.3.3 流式細(xì)胞儀 Annexin V/PI-FITC染色法分析細(xì)胞凋亡率:取上述分組1 ml細(xì)胞，1000 rpm，4℃離心10 min，棄上清;加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮;1000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復(fù)兩次。將細(xì)胞懸浮于200 μl的binding buffer;加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min;加入300 μl的binding buffer后用流式細(xì)胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)細(xì)胞凋亡的情況，判定早期及晚期凋亡率。將細(xì)胞混合液離心，取細(xì)胞沉淀涂片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行多因素方差分析及LSD兩兩比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對鎘染毒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的NO、sICAM-1和Cyt C的影響(表1) 鎘染毒的血管內(nèi)皮細(xì)胞NO值明顯低于正常對照組(P＜0.01)，sICAM-1濃度和Cyt C值明顯升高(P＜0.01);而鎘染毒同時(shí)補(bǔ)充硫酸鋅組血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷明顯減輕，NO值明顯高于Cd組(P＜0.01)，sICAM-1濃度和Cyt C值明顯降低(P＜0.01);其中，Cd+Zn組NO和Cyt C濃度(60 μm除外)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI染色法分析細(xì)胞凋亡率(表2，圖3) 按照Annexin V/PI-FITC熒光染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，對實(shí)驗(yàn)散點(diǎn)圖相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，正常對照組的早期與晚期凋亡率即LR與UR之和為(5.28±2.44)%，與正常對照組相比，鎘染毒組 5、10、30、60 μm 的早期與晚期凋亡率之和均顯著增加(P＜0.01)，其中鎘染毒60 μm組高達(dá)(39.49±39.03)%，而Cd+Zn組處理后，此數(shù)值顯著下降(P＜0.01)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 鋅對鎘染毒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后NO、sICAM-1和Cyt C的影響()

表1 鋅對鎘染毒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后NO、sICAM-1和Cyt C的影響()

注:與空白對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

鎘(μm)NO(μmol/L)sICAM-1(ng/L)Cyt C(nmol/L)Cd Cd+Zn Cd Cd+Zn Cd Cd+Zn NG 84.53±2.14 38.55±2.12 15.91±0.781 36.67±3.52* 90.43±4.21△ 50.25±3.71* 48.02±4.29* 31.13±1.44* 19.97±2.02△5 35.05±3.07* 89.06±3.27△ 65.17±6.01* 50.34±3.71＊△ 35.69±5.42* 19.47±4.01△10 34.19±4.43* 90.51±3.11△ 69.18±4.89* 50.61±4.11＊△ 38.87±3.71* 20.53±5.66△30 33.25±3.89* 81.19±2.56△ 71.32±5.46* 52.57±4.02＊△ 38.92±3.90* 20.78±7.10△60 29.91±5.18* 69.23±4.37△ 82.86±6.37* 55.88±6.13＊△ 45.53±7.74* 23.35±4.16＊△

表2 鋅對鎘染毒血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響()

表2 鋅對鎘染毒血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響()

注:與空白組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

LR+UR(%Gated)0 μm 1 μm 5 μm 10 μm 30 μm 60 μm 5.28±2.44 - - - - -Cd組 - 5.57±4.08 12.44±4.44* 13.97±5.81* 16.09±6.22* 39.49±39.03*Cd+Zn組 - 2.80±4.02 2.51±4.58△ 3.06±2.23△ 4.30±3.82△ 4.36±2.25空白組△

圖1 Annexin V/PI染色法細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

鋅是一種人體必需的微量元素，已知六大類、300多種酶的活性中心都有鋅的存在。鋅可調(diào)節(jié)基因表達(dá)，一些蛋白質(zhì)的特定序列可與鋅結(jié)合產(chǎn)生鋅指結(jié)構(gòu)序列(Zinc finger motif)，后者可與DNA特異序列結(jié)合，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。此外，鋅還參與信號傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、mRNA更新、穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)的抗自由基能力等重要生理功能［1］。

研究證實(shí)，鎘對人體具有多器官、多系統(tǒng)毒性，其毒性機(jī)制與誘發(fā)過氧化物生成、引起DNA損傷、線粒體受損、干擾細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)等多途徑有關(guān)，機(jī)制十分復(fù)雜［1］。舒張和收縮因子、促凝和抗凝因子及生長抑制和生長促進(jìn)因子的平衡失調(diào)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙、單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌的凋亡均可能是各器官鎘染毒損傷的重要機(jī)制之一。內(nèi)皮源性NO是天然血管保護(hù)劑和抗動脈硬化分子，病變血管內(nèi)皮NO合成下降和破壞增多是內(nèi)皮依賴性血管舒縮異常的主要原因［2，3］。黏附分子sICAM-1在血管內(nèi)皮損傷過程中，通過信號分子傳遞，激活轉(zhuǎn)錄因子NFKB，與靶基因細(xì)胞黏附分子基因位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子基因及黏附分子的表達(dá)，并介導(dǎo)單核細(xì)胞黏附、遷移穿過內(nèi)膜，始動AS早期的細(xì)胞行為［4］。而Cyt C的釋放被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡程序中的關(guān)鍵一步，在凋亡初期，Cyt C從線粒體內(nèi)膜釋放，從而啟動了線粒體的凋亡機(jī)制［5］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞鎘染毒損傷24 h后，sICAM-1含量明顯增加，NO水平下降，Cyt C濃度上升，且有與鎘水平呈正相關(guān)趨勢，5 μm水平以上鎘可引起內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯增加。Zn可升高NO水平，sICAM-1、Cyt C含量均明顯下降，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示鎘染毒同時(shí)補(bǔ)鋅可抑制由鎘染毒造成的內(nèi)皮功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制了單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而減少AS的發(fā)生。其作用機(jī)制、量效關(guān)系和安全性值得進(jìn)一步研究。

［1］余元勛，胡玲玲，余國斌主編，中國醫(yī)學(xué)分子微量元素學(xué)，安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

［2］Moncada S，Nitric oxide.Journal of Hypertension，1994，12(810):S35-39.

［3］Meredith IA，Yeung AC，Weidinger EF，et al.Role of impaired endothelium dependent vasodilation in ischemic manifestation of coronary artery disease.Circulation，1993，87(Suppl):56-66.

［4］Rahman A，AnwarKN，Minhajuddin M，et al.cAMP targeting of p38 MAP kinase inhibits thrombininduced NF-κB activation and ICAM-1 expression in endothelial cells.American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2004，287(5):1017-1024.

［5］Morita-Fujimura Y，F(xiàn)ujimura M，Kawase M，et al.Release of mitochondrial cytochrome C and DNA fragmentation after cold injuryinduced brain trauma in mice:possible role in neuronal apoptosis.Neuroscitt，1999，267(3):201-205.