文│張耀文（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心）

蔡擴軍（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院）

徐敏*（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心、烏魯木齊市奶業(yè)協(xié)會）

新疆是我國第一大駱駝養(yǎng)殖基地，現(xiàn)有駱駝25萬峰，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，駝乳不但營養(yǎng)價值高，且富含不飽和脂肪酸、維生素等營養(yǎng)成分，易被消化吸收，而且含有天然胰島素、胰島素蛋白質(zhì)等降血糖因子，對糖尿病治療有一定功效。另外，駝奶中的乳鐵傳遞蛋白、溶解酵素、免疫球蛋白可提高人體免疫力，是免疫力低下者的理想飲品。由于駝乳的價值逐漸被廣大消費者認(rèn)可，使得駝乳行業(yè)飛速發(fā)展，供不應(yīng)求。但駝乳的質(zhì)量安全應(yīng)引起廣大科研工作者的重視。

Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌，又叫大腸埃希氏菌。大腸桿菌是常在的條件性人畜共患病致病菌，又是重要的食源性細菌，在一定條件下可以引起人和動物局部組織器官感染。動物產(chǎn)品中大腸桿菌的污染給消費者帶來了安全隱患，其中乳源性大腸桿菌的危害已引起人們的極大關(guān)注，牛乳中大腸桿菌污染較多，而駝乳中大腸桿菌的污染報道極少。鑒于此，為調(diào)查本地生駝乳中大腸桿菌的污染情況，本研究利用熒光PCR快速檢測方法對生駝乳中大腸桿菌的污染情況開展調(diào)查，為保障駝乳質(zhì)量安全，促進駝乳產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展提供技術(shù)支撐。

一、材料與方法

1.主要試劑。大腸桿菌熒光PCR檢測試劑盒購自深圳澳東檢驗檢測科技有限公司；EC肉湯購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

2.主要儀器。熒光PCR儀（ABI 7500型）購自美國ABI公司；生物安全柜；細菌培養(yǎng)箱。

3.大腸桿菌的分離、檢測。

（1）樣品采集。采集生鮮駝奶90份，樣品放入含有冰袋的運輸箱內(nèi)低溫運輸至實驗室。

（2）檢驗程序。

（3）操作步驟，見圖1。

增菌：無菌取25毫升生駝奶樣品放入三角瓶，再加入225毫升的EC肉湯，36±1℃培養(yǎng)18～24小時。

提取樣品DNA：取1毫升菌液加到1.5毫升無菌離心管中，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清，加入50微升DNA提取液懸浮沉淀，充分混勻后沸水浴10分鐘，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，離心后取上清作為DNA模板檢測或保存于-20℃待檢測。陰性對照參與提取，以對環(huán)境進行監(jiān)控。陽性對照無需提取，直接使用。

反應(yīng)組份配制：按照大腸桿菌熒光PCR檢測試劑盒的說明書將樣品DNA、核酸擴增反應(yīng)液、反應(yīng)液、HS-Taq酶加至反應(yīng)管內(nèi)，反應(yīng)總體積為25微升，同時設(shè)置陰性和陽性對照。

PCR擴增：將配置好反應(yīng)液的反應(yīng)管置于熒光PCR儀器中，擴增程序為預(yù)變性95℃ 3分鐘、變性95℃5秒、退火/延伸60℃ 40秒，40個循環(huán)。熒光信號采集設(shè)定在退火/延伸時。對于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號采集通道，淬滅基團選None，染料校正選None。

（4）結(jié)果描述及判定。

陰性：無Ct值并且無擴增曲線，表示樣本陰性或者被檢測樣本核酸濃度含量低于1×102copies/毫升。

陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期，表示樣本陽性。

可疑：檢測樣本30＜Ct＜35時重復(fù)一次。如果Ct值仍小于35，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，可報告樣本陽性，否則報告樣本陰性或被檢測樣本核酸濃度含量低于1×102copies/毫升。

對照：陰陽性對照必須成立，否則此次實驗視為無效。

二、結(jié)果

根據(jù)大腸桿菌熒光PCR檢測試劑盒說明書進行結(jié)果判定，結(jié)果顯示，該試驗陰陽性對照成立，本批次一共檢測樣品90份，其中18份陽性，72份陰性，陽性率20%。

三、討論

近年來，駝乳在疾病輔助治療、營養(yǎng)保健、提高免疫力等方面的研究不斷深入，越來越受到廣大消費者的認(rèn)可，同時駝乳的質(zhì)量安全也引起了廣泛關(guān)注。駝乳中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等微生物污染是影響質(zhì)量安全的重要因素，大腸桿菌是環(huán)境中常在的條件性致病菌，駝乳可通過外源性污染和駱駝的內(nèi)源性感染造成其攜帶大腸桿菌，對消費者身體健康造成影響，具有一定的公共衛(wèi)生安全隱患。本研究結(jié)果顯示，駝乳中大腸桿菌的陽性率為20%，雖然檢出率顯著低于全國牛乳中大腸桿菌檢出率的平均水平，但應(yīng)引起相關(guān)部門的重視。由于駱駝一般采取傳統(tǒng)手工擠奶方式，易造成大腸桿菌的污染，建議相關(guān)部門制定駱駝擠奶技術(shù)規(guī)范，降低因擠奶不衛(wèi)生而造成的外源性污染。

大腸桿菌的檢測技術(shù)主要包括對核酸、繁殖代謝產(chǎn)物、特異性抗體等進行檢測，其中針對核酸DNA的PCR技術(shù)在檢測中得到廣泛應(yīng)用。熒光PCR方法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，隨著PCR擴增的進行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比增加，最后通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖，對PCR進程進行實時檢測。本研究利用熒光PCR技術(shù)，其操作方便快捷，具有較強的特異性和較高的靈敏度，實現(xiàn)了對生駝奶中大腸桿菌的快速檢測，為生駝乳中大腸桿菌的污染調(diào)查提供了技術(shù)支持。