劉忠平 李建榮 段銀河 李正金

（1.云南省馬龍縣畜牧獸醫(yī)局馬過河畜牧獸醫(yī)站，馬龍 655100；2.云南省馬龍縣畜牧獸醫(yī)局，馬龍 655100；3.云南省馬龍縣畜牧獸醫(yī)局通泉畜牧獸醫(yī)站，馬龍 655100）

犬細(xì)小病毒（canine Parvovirus，CPV）屬于犬細(xì)小病毒科（Pavoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus）是一種自主性復(fù)制病毒。1977年，美國Eengster首次報道了犬細(xì)小病毒（CPV）與犬出血性腸炎的聯(lián)系，自1978年中期起，全世界廣泛地區(qū)幾乎同時在所有年齡犬中爆發(fā)嚴(yán)重的出血性腸炎。據(jù)報道我國最早于1980年流行該病。1982年和1983年梁士哲、朱維正等和徐漢坤等確認(rèn)流行的犬出血性腸炎原為CPV。它是引起犬心肌炎，出血性腸炎和肺病而使犬大量死亡的重要原因，從而給養(yǎng)犬業(yè)和寵物業(yè)帶來巨大損失。發(fā)病率高達(dá)20%～100%，死亡率為10%～50%，在幼犬中本病的死亡率較任何其他傳染病高。患犬典型表現(xiàn)為嘔吐，腹瀉，糞便呈紅色膠凍樣。剖檢可見腸管膨大，腸壁上充血或出血，腸道內(nèi)充滿著膠凍狀內(nèi)容物或血水，4～6周齡幼犬剖檢后可見心室擴(kuò)展，懷疑為犬細(xì)小病毒感染引起的出血性腸炎和心肌炎。

犬最易感凡是養(yǎng)犬的地方都有本病的發(fā)生，特別常見于城市或犬類比較集中的地方。不同年齡、性別和品種的犬都可感染。但2月齡以內(nèi)的仔犬由于母源抗體的保護(hù)，80%不受感染3～12月齡的幼犬易感性高，犬細(xì)小病康復(fù)犬可獲終身免疫力。本病多發(fā)生于寒冷季節(jié)，有一定的周期性，每2～3年流行1次，但有些地方這種周期已經(jīng)不明顯，常年發(fā)生。因此，對犬細(xì)小病毒的研究和防治十分重要，做好病毒培養(yǎng)是做研究的前提。

1 材料與方法

1.1 材料

犬細(xì)小病毒、胎貓腎傳代細(xì)胞（FK81）（由成都軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學(xué)研究所提供）。

原料 洗液、營養(yǎng)液、NaHCO3溶液、血清抗生素。

儀器與設(shè)備 無菌操間、CO2溫箱、冰箱、吸耳球、水浴鍋、滅菌5ml、10ml吸管、滅菌中號培養(yǎng)瓶、瓶塞、酒精燈、高壓滅菌鍋、顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 洗液的配制

以上成分依次溶于450ml三餾水中，為使胰酶充分溶解可至于37℃水浴中加溫，務(wù)使溶體完全清涼，隨后加入1%酚紅1 ml再加10萬 U雙抗溶液5 ml加三餾水至500 ml，以G-6玻璃濾器或相應(yīng)的濾膜濾過除菌，分裝后置-20 ℃保存臨時用蒸餾水稀釋。

1.2.2 營養(yǎng)液的配制

稱E-EME培養(yǎng)基48 g溶于5 000 ml新燒的蒸餾水中，充分搖勻混均分裝在500ml的葡萄糖瓶中，每瓶裝400 ml密封起來放在小高壓鍋中滅菌，溫度調(diào)到121℃滅菌15 min即可。取出涼冷，然后往每瓶中依次加如以上溶液混合搖勻之后，放入冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2 細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)

2.1 胎貓腎傳代細(xì)胞（FK81）的培養(yǎng)

培養(yǎng)細(xì)胞 胎貓腎傳代細(xì)胞（FK81）來自于成都軍區(qū)病毒研究所，其傳代時需要0.25%的胰酶消化，細(xì)胞生長夜為含有8%的小牛血清、各為100 ug/ml的青、鏈霉素和L-谷胺酰胺（補(bǔ)加30 ug/ml）DMEM，維持液為含90 ug/ml的L-谷胺酰胺DMEM。此細(xì)胞具有分離CPV的作用。

2.2 犬細(xì)小病毒的培養(yǎng)

病毒增殖 采用同步接毒的方法，在細(xì)胞傳代的同時接種樣品，加入生長液，24小時后，將生長液棄去換上維持液，5天后收獲病毒。用此方法反復(fù)增殖病毒，用于純病毒。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

一般把犬細(xì)小病毒接種到FK81細(xì)胞中置于37 ℃的溫箱中培養(yǎng)，每天都要檢查，觀察2～5 d內(nèi)有無圓形多核巨細(xì)胞和空泡形成，并在胞漿內(nèi)出現(xiàn)包涵體，形狀好似一個個蜘蛛。巨細(xì)胞容易脫落，而且并非所有的細(xì)胞都形成巨細(xì)胞，故應(yīng)多次仔細(xì)檢查，同時用熒光抗體或瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測病毒抗原或作電鏡檢查。從細(xì)胞出病變到細(xì)胞脫落80%即可放入冰箱中冰凍，收集病毒。

3.2 分析

本試驗(yàn)方法簡便、易掌握，不需要昂貴的儀器與設(shè)備，但我們使用的玻璃器皿、原料等實(shí)驗(yàn)材料需達(dá)到試驗(yàn)要求和標(biāo)準(zhǔn)。若達(dá)不到要求和標(biāo)準(zhǔn)，就會導(dǎo)致試驗(yàn)誤差的偏大，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不精確。

我們的操作技術(shù)水平有限，操作不熟練。在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)過程中，紫外線殺菌不徹底；在傳代的過程中，洗液加入量過多或過少，消化細(xì)胞的時間把握不準(zhǔn)，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。要減小誤差，就得提高我們的操作技術(shù)水平，把握好時間，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。

4 討論

由于細(xì)胞生長旺盛，每毫升營養(yǎng)液負(fù)擔(dān)的細(xì)胞密度明顯高于單層培養(yǎng)細(xì)胞，因此，氧和營養(yǎng)成分的供應(yīng)必須十分充足。一般應(yīng)用雙倍濃度的氨基酸和維生素，例如2濃度的E—MeM，另外添加血清和細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨等營養(yǎng)補(bǔ)充劑，而且經(jīng)常是在培養(yǎng)過程多次追加新的營養(yǎng)液以保證細(xì)胞生長代謝的需要。

由于細(xì)胞在細(xì)胞迅速增殖以前，必須先對營養(yǎng)液作“條件化”改變，只有這種“條件化”了的營養(yǎng)液才能保證和促進(jìn)細(xì)胞大量增殖。

[1]楊德威，劉福安.不同種類細(xì)小病毒疫苗臨床應(yīng)用效果的檢測.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2000，25（2）：18～21

[2]侯云德.分子生物學(xué).北京：學(xué)苑出版社，1990

[3]朱平，PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作手冊. 北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1992

[4]王彥紅，徐向明 等.犬細(xì)小病毒YZ分離株的鑒定.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002，24（2）：440～443

[5]羅朝科，李超美，盛正太.進(jìn)境犬中犬細(xì)小病毒的分離鑒定.中國畜禽傳染病，1995，（4）：17～19

[6]金淮，徐漢坤，溫海，等.犬細(xì)小病毒的分離與鑒定.畜牧與獸醫(yī)，1990，22（3）：108～111