劉奕琳，王振宇，2＊

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090）

花色苷是一類具有苯并吡喃結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物，具有預(yù)防心臟病、抗大腦炎癥、抗癌、延緩衰老、抗輻射、清除自由基、抗氧化等多種功效[1－3]。藍(lán)靛果是一種藍(lán)黑色的漿果，含有豐富的天然綠色無(wú)毒的色素，是天然色素的良好來(lái)源。馬自超[4]鑒定了藍(lán)靛果色素中的主要成份是花青定-3-葡萄糖，其他少量成份是花青定-3，5-雙葡萄糖、花青定-3-蕓香糖、花青定-3-龍膽二糖、芍藥定-3-葡萄糖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)pH 示差法[5]測(cè)定藍(lán)靛果干物質(zhì)中花色苷的含量，并測(cè)定其對(duì)羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)靛果（Loniceraedulis），采摘于大興安嶺；無(wú)水乙醇；乙酸鈉；氯化鉀；鹽酸；DPPH Sigma公司、ABTS Sigma公司、無(wú)水乙醇、FeSO4、H2O2、水楊酸鈉、焦性沒(méi)食子酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；粉碎機(jī)；電子分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機(jī)；精密pH計(jì)；紫外分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)靛果花色苷的提取

將藍(lán)靛果烘干后用粉碎機(jī)粉碎，取10g藍(lán)靛果粉末，用200mL 60%乙醇溶液在常溫下浸提1h，將提取物在4000r／min離心10min后真空抽濾，濾餅再重復(fù)浸提2次，合并3次上清液，在40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，定容至250mL得花色苷提取液。取少量花色苷提取液，稀釋至一定體積，進(jìn)行光譜掃描，確定其測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.2 pH示差法的原理及緩沖液的配制

花色苷的顏色隨pH值的改變而發(fā)生變化，而干擾物質(zhì)的特征光譜不隨pH的改變而變化。為了讓pH示差法更準(zhǔn)確更靈敏，選擇的2個(gè)pH處測(cè)定的花色苷的吸光值差異最顯著，并且花色苷相當(dāng)穩(wěn)定。pH為1時(shí)，花色苷以2－苯基苯并吡喃的形式存在。pH為4.5時(shí)，花色苷以甲醇假堿的形式存在，因此選擇pH為1.0和4.5[6]

pH4.5的緩沖液的制備：準(zhǔn)確稱取1.64g乙酸鈉用蒸餾水定容100mL，用鹽酸調(diào)pH（4.5±0.1）。

pH 1的緩沖液的制備：準(zhǔn)確稱取1.49gKCl用蒸餾水定容至100mL。準(zhǔn)確量取1.7mL鹽酸用蒸餾水定容至100mL，配制成0.2mol／L鹽酸溶液，將KCl溶液與鹽酸溶液以25∶67的比例混合。用KCl溶液調(diào)pH（1.0±0.1）。

1.3.3 平衡時(shí)間的確定

因?yàn)榛ㄇ嗨卦谌芤航橘|(zhì)中存在4種結(jié)構(gòu)形式，這4種結(jié)構(gòu)形式在某一pH下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)pH改變時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，總的趨勢(shì)是pH降低時(shí)，平衡向紅色的2－苯基苯并吡喃陽(yáng)離子移動(dòng)；pH升高時(shí)平衡向藍(lán)色醌式移動(dòng)。一定時(shí)間后達(dá)到一個(gè)新的平衡。因此提取液用緩沖液稀釋后，必須先靜置一段時(shí)間，等動(dòng)態(tài)平衡處于穩(wěn)定后，才能測(cè)定吸光值。

分別移取2份2mL花色苷提取液，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液定容至50mL，在所選擇的測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每隔10min測(cè)定一次吸光值，直至穩(wěn)定。

血液中甘油三酯含量反映了機(jī)體對(duì)脂類的利用情況，甘油三酯含量越低意味著對(duì)機(jī)體脂肪的利用率越高。本試驗(yàn)添加過(guò)瘤胃脂肪后，處理組甘油三酯含量均較對(duì)照組低（P＞0.05），說(shuō)明處理組脂肪利用率較對(duì)照組高。

1.3.4 經(jīng)驗(yàn)公式的選擇

花色苷含量（%，w／w）＝（A／εL）×MW×DF×V／Wt×1000

式中：A－吸光度；ε－矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900；DF－稀釋因子；MW－矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；V－最終體積，mL；Wt－產(chǎn)品重量，mg；L－光程，1cm；A＝ApH1.0－ApH4.5。

1.3.5 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.5.1 羥自由基清除能力的測(cè)定。參照徐建國(guó)等[7]采用的水楊酸鈉絡(luò)合法略作改動(dòng)，測(cè)定樣品清除羥自由基的能力。反應(yīng)體系中依次加入樣品液1mL，濃度為6mmol／L FeSO4溶液2mL，濃度為6mmol／L H2O2溶液2mL，將反應(yīng)體系混合均勻放置10min，再加入濃度為6mmol／L水楊酸鈉溶液2mL，靜置30min后于510nm波長(zhǎng)下用蒸餾水調(diào)零，并測(cè)定吸光值A(chǔ)1；將上述體系中的水楊酸鈉溶液用相同體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)2；將上述體系中的樣品溶液用相同體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。羥自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.2 超氧自由清除能力的測(cè)定。參照郭雪峰[8]方法略作改動(dòng)，測(cè)定樣品清除超氧自由基的能力。反應(yīng)體系中依次加入濃度為50mmol／L Tris-HCl溶液5.7mL，樣品溶液0.2mL，濃度為6mmol／L鄰苯三酚溶液0.1mL，將混合物反應(yīng)4min，滴入2滴HCl終止反應(yīng)，在320nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)1；將鄰苯三酚用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)2；將樣品溶液用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。超氧自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定。參照Blois等[9]的方法略作改動(dòng)，測(cè)定樣品清除DPPH自由基的能力。配制0.2mmol／L DPPH乙醇溶液，放在棕色試劑瓶中于4℃保存，在試管中加入2mL DPPH乙醇溶液及2mL樣品溶液，混合均勻在室溫避光放置30min，于517nm波長(zhǎng)下用無(wú)水乙醇調(diào)零，并測(cè)定吸光值A(chǔ)1；將DPPH乙醇溶液用等體積的無(wú)水乙醇代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)2；將樣品溶液用等體積無(wú)水乙醇溶液代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。DPPH自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.4 ABTS自由基清除能力的測(cè)定。參照 Wanwisa等[10]方法略作改動(dòng)，測(cè)定樣品清除ABTS自由基的能力。用2.6mmol／mL過(guò)硫酸鉀溶液溶解ABTS甲醇溶液，配制成7.4mmol／mL ABTS儲(chǔ)備液，室溫避光靜置12～24h后4℃保藏?，F(xiàn)用時(shí)取1mL儲(chǔ)備液用甲醇稀釋54.7倍，在734nm吸光值為0.700±0.020，甲醇調(diào)零。在試管中加入2.850mL ABTS測(cè)定液及0.150mL樣品溶液，混合均勻在室溫避光放置2h，于734nm波長(zhǎng)下用甲醇調(diào)零，并測(cè)定吸光值A(chǔ)1；將ABTS測(cè)定液用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)2；將樣品溶液用等體積甲醇溶液代替，其他操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。ABTS自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

藍(lán)靛果花色苷的提取液經(jīng)稀釋后，經(jīng)光譜掃描如圖1所示，確定其最大吸收波長(zhǎng)為531nm。

圖1 光譜掃描曲線

2.2 平衡時(shí)間的確定

表1 藍(lán)靛果花色苷在緩沖溶液中的吸光值與時(shí)間變化關(guān)系

2.3 藍(lán)靛果干物質(zhì)中花色苷的含量

由表1中的數(shù)據(jù)，取平衡時(shí)間60min，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算得花色苷的含量（%，w／w）＝（A／εL）×MW×DF×V／Wt×1000＝（1.500－0.328）×0.250×25×449.2×1000／（26900×10×1）＝12.232mg／g。

2.4 清除羥自由基的能力

羥基自由基（·OH）是化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種自由基，建立一種Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基的方法，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定其清除率如圖2所示。

圖2 樣品對(duì)羥自由基的清楚能力

由圖2可以看出，花色苷對(duì)羥自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，而且清除率比VC對(duì)照組高，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2mg／mL時(shí)，花色苷的清除率為90.35%，VC的清除率為58.31%，可見(jiàn)藍(lán)靛果花色苷對(duì)羥自由基有極強(qiáng)的清除能力。

2.5 清除超氧自由基的能力

超氧陰離子自由基（O2—·）是生物體中產(chǎn)生量最多的一種氧自由基。由鄰苯三酚的方法，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定其清除率如圖3所示。

圖3 樣品對(duì)超氧自由基的清除能力

由圖3可以看出，花色苷對(duì)超氧自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，但清除率比VC對(duì)照組低，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2mg／mL時(shí)，花色苷的清除率為87.35%，VC的清除率為97.53%，可見(jiàn)藍(lán)靛果花色苷對(duì)超氧自由基有一定的清除能力。

2.6 清除DPPH自由基的能力

二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，花色苷等抗氧化劑能與其結(jié)合使溶液顏色變淡，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定其清除率如圖4所示。

由圖1可以看出，花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，但清除率比VC對(duì)照組低，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2mg／mL時(shí)，花色苷的清除率為84.39%，VC的清除率為96.74%，可見(jiàn)藍(lán)靛果花色苷對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖4 樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.7 清除ABTS自由基的能力

ABTS[2，2＇-邊氮基－雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]是一種供氫體。該方法作為一種用于體外測(cè)定物質(zhì)總抗氧化能力的新方法，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定其清除率如圖5所示。

圖5 樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力

由圖5可以看出，花色苷對(duì)ABTS自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，而且清除率比VC對(duì)照組高，當(dāng)質(zhì)量濃度為10μg／mL時(shí)，花色苷的清除率為87.98%，VC的清除率為60.52%，可見(jiàn)藍(lán)靛果花色苷對(duì)ABTS自由基有極強(qiáng)的清除能力。

3 結(jié)論

藍(lán)靛果是具有花色苷的一種漿果，實(shí)驗(yàn)用pH示差法測(cè)定花色苷含量，方法可靠準(zhǔn)確，結(jié)果顯示其花色苷在干物質(zhì)中的含量為12.232mg／g，可見(jiàn)其含量豐富。

藍(lán)靛果花色苷對(duì)四種自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)于羥自由基和ABTS自由基的清除能力較VC陽(yáng)性對(duì)照組強(qiáng)，而對(duì)于超氧自由基和DPPH自由基的清除能力較VC陽(yáng)性對(duì)照組低，實(shí)驗(yàn)表明，藍(lán)靛果花色苷具有較強(qiáng)的抗氧化性，可以作為天然綠色的抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域，具有很大的發(fā)展前景。

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