蔣 霞 潘 鋒 陳建永 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科 杭州 310003

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是以腹部疼痛或不適為主，伴有大便性狀或排便習(xí)慣改變，持續(xù)存在或間歇發(fā)作，無形態(tài)學(xué)和生化異常改變的征候群。目前研究表明，50%～70%的IBS患者腸道疼痛閾值低于正常，其腸道處于高敏感狀態(tài)，而內(nèi)臟感覺的高敏感性可能與神經(jīng)調(diào)節(jié)和傳遞介質(zhì)釋放失調(diào)或感覺神經(jīng)末梢對這些介質(zhì)的敏感性增高有關(guān)。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作為神經(jīng)傳遞和調(diào)節(jié)介質(zhì)，是疼痛感覺及痛覺過敏產(chǎn)生所必需的物質(zhì)，在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺和運(yùn)動中起重要作用。呂賓等[1]在內(nèi)臟高敏感大鼠的腦干多個核團(tuán)中發(fā)現(xiàn)CGRP表達(dá)有明顯增加。我們應(yīng)用痛瀉要方干預(yù)內(nèi)臟高敏感大鼠，觀察其腦干孤束核CGRP表達(dá)的變化，以探討痛瀉要方的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 SPF級雄性Wistar大鼠56只，體重180～200g，清潔級，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SYXK（浙）2008-0115）。所有動物在有恒溫、恒濕及晝夜光線變化的房間里分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥 物 番瀉葉購自浙江省醫(yī)藥公司（杭州桐君堂中藥飲片廠）。將番瀉葉置60℃烘箱中密封水浸泡12h，紗布過濾濃縮為100%濃度，4℃儲存?zhèn)溆谩Ｍ礊a要方顆粒劑（含白芍、防風(fēng)、白術(shù)各12g，陳皮6g，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）用滅菌蒸餾水按1∶1沖兌，4℃儲存?zhèn)溆?。將得舒特（通用名：匹維溴銨，法國蘇威特制藥公司，批號H20070059，50mg/粒）用研缽研細(xì)，100目過篩，用滅菌蒸餾水按1∶1沖兌，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組、對照組，每組14只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組、治療組、對照組先灌服番瀉葉煎劑10g/kg，1天1次，連續(xù)2周；2周后加用束縛桶束縛大鼠肩部、前肢及胸部，限制大鼠用前肢搔抓頭面部，但不限制其活動，束縛時間為1h，1天1次，連續(xù)2周。

2.2 藥物干預(yù) 自第4周起，模型組予0.15mL生理鹽水灌胃，治療組予0.15g/0.15mL痛瀉要方水溶液灌胃，對照組予3mg/0.15mL得舒特水溶液灌胃，連續(xù)2周。正常組大鼠同步飼養(yǎng)，予等劑量生理鹽水灌胃6周。

2.3 標(biāo)本采集 第6周末，在25%烏拉坦腹腔麻醉下，開胸，暴露心臟，從左心室插管至升主動脈，經(jīng)升主動脈用500mL生理鹽水灌流沖洗血液，并剪開右心耳，至肝臟完全變白，從右心耳流出無色的沖洗液后，再用新鮮配置的固定液（含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液）500mL灌流，至四肢、脊柱變硬（時間約40min），立即取腦，在上述固定液中固定2～4h（4℃），再移入含30%蔗糖的PB液內(nèi)直至組織沉淀（4℃），沉淀時間約48h。取出后在大腦腳底做一冠狀切面，剝離小腦，將腦干做冰凍連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，隔6取1，收集于三套玻片上，分別做CGRP免疫組化、陰性對照及Nissl染色。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 評估腸道敏感性[2]6周后，采用直結(jié)腸擴(kuò)張刺激的方法觀察大鼠腹部回縮反射。每組隨機(jī)選取6只大鼠，乙醚麻醉下，用石蠟油潤滑后的動脈栓子清除術(shù)導(dǎo)管經(jīng)肛門插入，氣囊末端距離肛門1cm，用膠布把導(dǎo)管和鼠尾根部纏在一起以固定氣囊，將大鼠放入只能前后運(yùn)動的透明籠中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后，向囊內(nèi)逐漸注水?dāng)U張腸道，觀察大鼠腹部抬高（3分）及背部拱起（4分）時的容量閾值，進(jìn)行評估。為得到準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，每次操作重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

腹部回縮反射（Abdominalwithdrawal reflex，AWR）行為評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，大鼠情緒基本穩(wěn)定，無行為學(xué)反應(yīng)；1分，大鼠情緒不穩(wěn)定，扭動頭部；2分，大鼠腹背部肌肉輕微收縮，但腹部未抬離地面；3分，大鼠腹背部肌肉較強(qiáng)收縮，腹部抬離地面；4分，大鼠腹背部肌肉強(qiáng)烈收縮，背部呈弓形并把腹部、骨盆及會陰部抬離地面。1分看作是大鼠的感覺容量閾值，2分作為痛覺敏感閾值，4分作為痛覺最大耐受容量閾值。觀察大鼠達(dá)到3分和4分行為標(biāo)準(zhǔn)時的注水量，通過注水量反應(yīng)其腸道的敏感性，腸道敏感性越高，達(dá)到3分、4分行為標(biāo)準(zhǔn)者注水量越少。

2.4.2 評估腹壁緊張度 每組隨機(jī)選取6只大鼠，用苯巴比妥（30mg/kg）麻醉，將一銀制雙極電極縫合到腹股溝韌帶上方、距中線1.5cm的一側(cè)腹外斜肌上。電極的游離端經(jīng)皮下隧道置于頸后，用膠布固定。手術(shù)后5天開始肌電記錄。乙醚麻醉下，將上述球囊導(dǎo)管經(jīng)肛門插入直腸內(nèi)，球囊末端距離肛門1cm，電極導(dǎo)線的兩端連接電生理記錄儀。大鼠蘇醒30min后，分別在 0、0.5、0.8、1.6mL 容量下進(jìn)行直腸擴(kuò)張。每次膨脹持續(xù)5min，記錄5min內(nèi)腹壁收縮數(shù)量，每次擴(kuò)張結(jié)束時，將水回抽，檢測球囊有無漏水。用PowerLab電生理記錄儀記錄腹壁肌電活動，高頻濾過設(shè)置為10Hz，低頻濾過為1kHz，電壓1mV。肌電活動增高超過基線水平100μV以上認(rèn)為是1次有意義的腹壁收縮活動。

2.4.3 免疫組化ABC法 大腦片經(jīng)0.3%H2O2的甲醛溶液處理30min，然后用0.01%mol/L的PBS洗滌4次，加入抗體稀釋液37℃恒溫箱中孵育1h，再加1：2000 兔抗鼠 CGRP（購自 Sigma公司 c8198），4℃冰箱72h，PBS洗滌4次，加1：200的生物素化羊抗兔抗體（購自sigma公司B7389），4℃冰箱48h，PBS洗滌4次，加1：200鏈霉親和素－辣根過氧化物酶復(fù)合物（購自 sigma公司 PK-4000），4℃冰箱 24h，PBS洗滌4次，室溫（20℃左右）下加 DAB 顯色 10～15min，PBS洗滌中止反應(yīng)，室溫下干燥，85%、90%、95%、100%、100%、100%酒精上行逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用PBS代替一抗，進(jìn)行空白對照，同步進(jìn)行上述免疫組化染色，結(jié)果為陰性。

Nikon ECLIPSE E-600電子顯微鏡觀察，在目鏡上放置正方形網(wǎng)格，記錄鏡下（10×40倍）一個網(wǎng)格所覆蓋面積下的陽性細(xì)胞數(shù)，折算成每平方毫米的陽性細(xì)胞數(shù)，并照相。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 各核團(tuán)單位面積CGRP陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果以（） 表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Tambane’S T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大體觀察 正常組大鼠體重明顯增加，大便正常，耗食量正常。其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度體重增長緩慢或下降：治療組大鼠于第2～3天開始出現(xiàn)煩躁、大便次數(shù)增多、大便水分增多；對照組大鼠第2天開始出現(xiàn)大便次數(shù)增多、稀便、肛門口污穢、拱背、萎靡、蜷臥少動、喜聚堆等表現(xiàn)；模型組大鼠兼有以上兩組表現(xiàn)，大便完全為稀便，大鼠嗜臥扎堆，毛色無華、變脆。

3.2 各組大鼠腸道敏感性和腹壁緊張度比較 正常組、治療組、對照組大鼠腹部回縮反射直腸擴(kuò)張容量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。不同直腸擴(kuò)張強(qiáng)度下大鼠腹壁收縮次數(shù)比較見表2。

表1 各組大鼠腹部回縮反射直腸擴(kuò)張容量比較（） mL

表1 各組大鼠腹部回縮反射直腸擴(kuò)張容量比較（） mL

注：與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n/只 腹部抬高 背部拱起正常組 6 0.65±0.09△ 1.04±0.12△模型組 6 0.42±0.05 0.60±0.04治療組 6 0.70±0.06△ 1.06±0.18△對照組 6 0.68±0.08△ 1.05±0.07△

表2 不同直腸擴(kuò)張強(qiáng)度下大鼠腹壁收縮次數(shù)比較（） 次/5min

表2 不同直腸擴(kuò)張強(qiáng)度下大鼠腹壁收縮次數(shù)比較（） 次/5min

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 n/只 0.5mL 0.8mL 1.6mL正常組 6 0.63±0.02△ 3.67±1.32△△ 15.90±4.23模型組 6 5.63±0.16 9.10±1.35 17.60±3.76治療組 6 0.63±0.03△ 4.23±1.46△△ 16.78±4.12對照組 6 0.65±0.02△ 4.45±1.31△△ 16.45±4.28

3.3 免疫組化結(jié)果 典型的CGRP免疫陽性神經(jīng)元表現(xiàn)為胞漿染色呈棕褐色，胞核不著色，神經(jīng)元呈現(xiàn)空泡狀。每組大鼠腦干孤束核均表達(dá)CGRP免疫陽性神經(jīng)元，呈雙側(cè)分布，組間表達(dá)有差異。正常組、模型組、治療組、對照組四組大鼠腦干CGRP免疫陽性神經(jīng)元個數(shù)分別為 83.87±9.54 個/mm2、125.89±14.93個/mm2、97.18±12.49 個/mm2、91.52±10.76 個/mm2。正常組、治療組、對照組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

電鏡下各組大鼠孤束核CGRP表達(dá)見圖1～4。

4 討 論

已有研究[3]發(fā)現(xiàn)，CGRP與痛覺信號的傳遞有密切關(guān)系，脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射CGRP可使痛閾降低，它可以通過促進(jìn)SP的釋放而有利于痛覺的傳遞。在甲醛致痛實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)投射到脊髓背角淺層的初級傳入神經(jīng)末梢中的CGRP樣免疫活性物質(zhì)明顯增多；佐劑性關(guān)節(jié)炎痛時，脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元內(nèi)CGRP-mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)；鎮(zhèn)痛藥可使DRG內(nèi)CGRP免疫活性物質(zhì)含量和脊髓內(nèi)釋放CGRP明顯減少，并可使痛覺過敏程度減輕[4]，上述實(shí)驗(yàn)均提示CGRP參與了痛覺信息的傳遞及痛覺過敏的形成。我們既往研究發(fā)現(xiàn)[1]，CGRP在內(nèi)臟高敏感大鼠腦干多個核團(tuán)的表達(dá)增加，尤其是孤束核的表達(dá)明顯增加，提示高級神經(jīng)中樞可以通過調(diào)控CGRP在腦干核團(tuán)的表達(dá)參與痛覺過敏的形成。

孤束核是一個位于延髓背側(cè)，包繞于孤束周圍的Y字形柱狀核團(tuán)，它有廣泛的傳入傳出聯(lián)系，是內(nèi)臟的初級傳入及調(diào)節(jié)中樞，與胃腸道活動的調(diào)節(jié)以及鎮(zhèn)痛等多種功能有關(guān)。孤束核的上端能夠接受來自味覺的初級感覺纖維，其余各部分則接受來自臟器和心血管等的初級感覺纖維，這些纖維進(jìn)入核團(tuán)以前在腦干內(nèi)形成縱行的孤束，孤束核的細(xì)胞分布于孤束周圍并接受其纖維的終止，直接參與調(diào)控內(nèi)臟活動。另外，作為中轉(zhuǎn)站，孤束核的上行傳遞系統(tǒng)既能傳入大腦皮質(zhì)，又能間接聯(lián)系邊緣系統(tǒng)，通過更高級別中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與內(nèi)臟運(yùn)動。

本實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過灌服番瀉葉煎劑加束縛桶限制活動后，大鼠的痛閾明顯降低，直腸注水量明顯減少，在孤束核CGRP的表達(dá)明顯增多，其腸道的敏感性增加，而經(jīng)過痛瀉要方灌胃后的大鼠痛閾明顯上升，孤束核CGRP表達(dá)明顯減少，腸道敏感性下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示痛瀉要方可能通過減少高級神經(jīng)中樞孤束核CGRP的表達(dá)而發(fā)揮減輕痛覺過敏的作用。

本組結(jié)果顯示，孤束核作為內(nèi)臟感覺刺激傳入通路的終止處以及中轉(zhuǎn)站，參與了疼痛刺激信息的傳遞及調(diào)控，痛瀉要方可以減輕內(nèi)臟敏感性，減少大鼠痛覺過敏的形成，而降低孤束核CGRP的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

［1］呂賓，蔣霞.內(nèi)臟高敏感大鼠腦干降鈣素基因相關(guān)肽、c-fos基因表達(dá)的研究［J］.胃腸病學(xué)，2007，12（11）：681-684.

［2］劉雁冰，袁耀宗.大鼠腸道高敏性模型的建立及其內(nèi)臟敏感性評估［J］.中華消化雜志，2003，23（1）:34-37.

［3］Christensen MD，Hulsebosch CE.Spinnal cord injury and anti NGF treatment results in changes in CGRP density and distribution in the dorsal horm in the rat［J］.Exp Neurol，1997，147（2）：463-475.

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