謝志軍 曹靈勇 溫成平 范永升 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

卞 華 河南南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院

系統(tǒng)性硬皮病（systemic seleroderma，SSc）是一種以彌漫性皮膚增厚和纖維化為主要臨床特征、可影響內(nèi)臟的難治性結(jié)締組織病。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積，是其重要環(huán)節(jié)之一[1-3]。我們臨床應(yīng)用溫陽通絡(luò)方治療該病，取得一定療效，并采用血清藥理學(xué)方法探討該方對(duì)硬皮病患者皮損組織成纖維細(xì)胞膠原合成的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 含藥血清制備 12例SSc患者分成SSc對(duì)照組（初診未治療者）、西藥組、中藥組、中西藥聯(lián)合組，每組3例。西藥組口服青霉胺（1次0.125g，1天3次）和強(qiáng)的松（1次20mg，1天1次）；中藥組給予溫陽通絡(luò)方煎劑（基本方：黃芪15g，桂枝10g，仙靈牌、桃仁各12g，丹參20g，積雪草12g，白芥子10g，香附15g，全蝎 3g。水煎服，1天 1劑，早晚各 1次）。中西藥聯(lián)合組給予青霉胺、強(qiáng)的松和溫陽通絡(luò)方煎劑（劑量、用法與西藥組、中藥組相同）。療程均2個(gè)月。

空腹抽取SSc對(duì)照組患者靜脈血，經(jīng)2000r/min離心15min，分離血清，56℃水浴滅活補(bǔ)體，-20℃保存?zhèn)溆茫晃魉幗M、中藥組、中西藥聯(lián)合組經(jīng)治療2個(gè)月后，空腹抽取靜脈血，血液標(biāo)本處理同上，制備含藥血清。

1.2 皮膚成纖維細(xì)胞系原代培養(yǎng) 在局麻無菌條件下，分別切取一名24歲男性包皮過長(zhǎng)者的正常包皮和一名36歲女性肢端型SSc患者腹股溝處活動(dòng)性硬化皮損組織，剪去表皮及皮下脂肪組織，將組織塊反復(fù)剪碎成漿，梅花狀滴入25mL的培養(yǎng)瓶中，各點(diǎn)間距約0.5cm，再加入含20%的DMED培養(yǎng)基1.5mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，4～6h貼壁后，使培養(yǎng)基浸入真皮皮漿，繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常皮膚和SSc皮膚成纖維細(xì)胞，配成終濃度為5×l06/mL細(xì)胞懸液。轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2濃度及100%濕度培養(yǎng)箱中孵育24h，待細(xì)胞貼壁后，吸出上清液，無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。然后分別加入20%的SSc對(duì)照組血清或各處理組含藥血清（血清濃度為經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索后確定的有效濃度），正常對(duì)照組給予20%正常血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 引物設(shè)計(jì) 首先在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/的“nucleotide”中查詢?nèi)烁髂康幕蛉玞DNA序列；采用Primer5.0軟件進(jìn)行目的基因序列的上、下游引物設(shè)計(jì)，然后在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的nucleotide blast中進(jìn)行blast程序比對(duì)。最后確定的上下游引物序列見表1。

表1 CDNA上下游引物序列

引物稀釋：將訂購(gòu)的引物EP管分別經(jīng)10000r/min離心5s后加入DEPC水各200μL，然后將上下游引物混合，-20℃保存?zhèn)溆?。Oligo dT及 MML-V 10000r/min離心5s，Oligo dT離心后加入300μL DEPC水配成50pmol/μL濃度的工作液。

1.4 SSc成纖維細(xì)胞總RNA提取 上述細(xì)胞經(jīng)加入不同含藥血清20%培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，棄去上清液，每孔分別加入消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA

各lmL），配成濃度為3×106/mL細(xì)胞懸液，TRIzol試劑一步法提取總RNA。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA及PCR擴(kuò)增 逆轉(zhuǎn)錄體系總體積為25μL，反應(yīng)體系如下：總RNA 2μL、Oligo（dT）5μL、5×M-MLV Buffer4μL、dNTP（2.5mM） 6μL、Rnase Inhibitor 0.5μL、M-MLV 0.5μL， 加 ddH2O（DEPC處理）至25μL，42℃水浴箱反應(yīng) 1h，再取cDNA產(chǎn)物與上述上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6 DNA電泳及圖像分析 取上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后以BIO-RAD凝膠成像儀紫外光下拍照，圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析，以β-actin作為內(nèi)參照。最后以目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量為參數(shù)進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（） 表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常皮膚比較，SSc患者皮損組織成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量明顯增多（P＜0.01）；與SSc對(duì)照組比較，20%不同含藥血清處理后各處理組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量明顯減少（P均＜0.01）；中藥組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量顯著高于西藥組和中西藥組（P均＜0.01），中西藥組顯著低于西藥組（P＜0.01）。各組SSc皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1mRNA表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P均＜0.01）；各組間SSc皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2，圖 1～3。

表2 各組I、III型膠原及MMP-1mRNA表達(dá)量比較（，n=3）

表2 各組I、III型膠原及MMP-1mRNA表達(dá)量比較（，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與 SSc對(duì)照組比較，△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.01

組 別 I型膠原 III型膠原 MMP-1 SSc對(duì)照組 0.771±0.016*▲ 0.808±0.017*▲ 0.547±0.017*西藥組 0.468±0.011*△ 0.509±0.011*△ 0.523±0.014*中藥組 0.686±0.013*△▲ 0.564±0.014*△▲ 0.537±0.015*中西藥組 0.462±0.012*△▲ 0.219±0.009*△▲ 0.525±0.014*正常對(duì)照組 0.180±0.009△▲ 0.175±0.007△▲ 0.487±0.013

圖1 各組成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖2 各組成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 各組成纖維細(xì)胞MMP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

SSc 屬中醫(yī)“皮痹”、“血痹”、“肌痹”、“臟腑痹”等范疇?！端貑枴け哉摗吩疲骸氨栽诠莿t重，在于脈則血凝不流，在于筋則屈不伸，在于肉則不仁，在于皮則寒”?！吨T病源候論》謂：“風(fēng)濕痹之狀或皮膚頑厚……風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹，由氣血虛又受風(fēng)濕而成此病，久不愈入經(jīng)絡(luò)”。中醫(yī)認(rèn)為，該病因陽氣不足，風(fēng)寒乘虛侵襲，凝結(jié)于經(jīng)絡(luò)，氣血凝滯，閉塞不通而發(fā)病。病機(jī)關(guān)鍵在于正虛、寒凝和血瘀，屬本虛標(biāo)實(shí)。鑒此，我們確定溫陽祛瘀法，以標(biāo)本兼治。溫陽通絡(luò)方中黃芪能“榮筋骨”，療“賊風(fēng)之病，偏中血脈，而手足不隨著”（《本草匯言》）；桂枝能“開腠理，解表，去皮風(fēng)濕”（《主治秘訣》），“散風(fēng)寒，去肢節(jié)間風(fēng)痛”（《本草匯言》），且善入血分，為溫通血脈之要藥；桃仁“治皮膚凝聚之血”（《本草備要》），“主血滯風(fēng)痹”（《本草綱目》）；丹參能“養(yǎng)血，去腰脊強(qiáng)，腳痹”（《名醫(yī)別錄》），“療風(fēng)痹”（《本草經(jīng)集注》）。藥理研究表明，黃芪可促進(jìn)T細(xì)胞的分化和成熟，擴(kuò)張血管，降低血小板黏附率，減少血栓形成，抗缺氧等。桂枝能抗炎，增加冠狀動(dòng)脈血流量。桃仁具有改善血流變學(xué)，抗炎、抗過敏等作用。丹參能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善血液流變性，降低血液黏稠度，抑制凝血，抑制血小板聚集及黏附[4]。丹參還能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成[5-6]。因此，溫陽祛瘀法治療SSc可能以改善微循環(huán)及結(jié)締組織代謝為主要環(huán)節(jié)，對(duì)免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌起到調(diào)節(jié)性作用。

正常情況下，ECM合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡。Jelaska等[7]證明SSc中部分皮膚成纖維細(xì)胞被激活，其I型前膠原mRNA表達(dá)明顯增多。Zurita-satinas等[8]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的SSc皮損成纖維細(xì)胞的膠原合成與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)顯示，SSc患者皮損組織成纖維細(xì)胞I、III型膠原mRNA表達(dá)明顯多于正常皮膚，說明SSc患者成纖維細(xì)胞的膠原合成量增加，提示結(jié)締組織的異常代謝是SSc發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，溫陽祛瘀藥物在一定程度上干擾SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞I、III型膠原mRNA的表達(dá)，而對(duì)膠原酶的干預(yù)作用不明顯，其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Varga JA，Trojanowska M.Fibrosis in systemic sclerosis［J］.Rheum Dis ClinNorth Am，2008，34：115-143.

［2］Ihn H.Scleroderma，fibroblasts，signaling，and excessive extracellularmatrix［J］.Curr Rheumatol Rep，2005，7：156-162.

［3］ Gabrielli A，Avvedimento EV，Krieg T.Scleroderma［J］.N Engl J Med，2009，360：1989-2003.

［4］雷載權(quán)，張延模.中華臨床中藥學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：1613，191，122，1106.

［5］李明，王強(qiáng)，楊春欣，等.丹參對(duì)系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞膠原基因表達(dá)的影響［J］.中華皮膚科雜志，1999，32（l）：47-48.

［6］高慧，楊邦杰，嚴(yán)華，等.丹參注射液治療系統(tǒng)性硬皮病藥理機(jī)制研究［J］.中成藥，1999，21（2）：98-99.

［7］ Jelaska A，Arakawa M，Broketa G，et al.Heterogeneity of collagen synthesis inNormal and systemic slerosis skin fibroblasts.Inereased proportion of high collagen-Producing cells in systemic selerosis fibroblasts［J］.Arthritis-Rheum，1996，39（8）：1338-1346.

［8］Zurita-Satinas CS，Richaud-Patin Y，Krotzseh-Gomez E，et al.Spontaneouscytokine gene expression by cμLtured skin fibroblast of systemic sclerosis.Correlation with collagen synthesis［J］.Revlnvest Clin，1998，50（2）：97-104.