李默馨，劉 晶，周曉丹，高宇薇，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

超臨界CO2狀態(tài)下直接酯化法制備共軛亞油酸甘油酯

李默馨，劉 晶，周曉丹，高宇薇，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

在超臨界CO2狀態(tài)下，采用脂肪酶催化共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)與甘油反應制備共軛亞油酸甘油酯，分別應用單因素和正交試驗考察分子篩添加量、酶用量、反應壓力、溫度和時間對CLA酯化率的影響。結果表明，最佳工藝條件為分子篩用量6%、酶用量4%、反應溫度60℃、反應時間20h、反應壓力11MPa，此條件下CLA的酯化率可達到90.98%。這種CLA甘油酯的脂肪酸組成中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分別為37.79%和41.66%。

超臨界CO2；共軛亞油酸；甘油酯；CLA酯化率

共扼亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸的一組位置和幾何異構體的通稱，科學證實9c,11t-CLA和10t,12c-CLA具有抑制腫瘤、抗動脈粥樣硬化、降低生物體脂肪等生理活性[1-2]。天然的共軛亞油酸主要存在于瘤胃動物牛、羊等的乳汁和肉制品中，但含量很少[3]，鑒于CLA的這些生理功能，人們一直期望在膳食中含有一定量CLA的同時提高其吸收率。但CLA以游離酸的形式存在時，易氧化，口感不好，且不易被身體吸收[4-5]，因此制備CLA的甘油酯產(chǎn)品，具有廣闊的應用前景。

CLA甘油酯產(chǎn)品的獲得主要有化學法和酶法兩種。傳統(tǒng)應用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)的甘油酯產(chǎn)品主要是采用化學法催化油脂甘油制得的[6]，但此法存在著反應溫度高、化學污染嚴重、產(chǎn)物色澤差等缺點；目前，國內外多以酶催化法合成，該法在有機溶劑和無溶劑中反應都取得了較好進展，但在超臨界二氧化碳(SC-CO2)狀態(tài)酶法催化合成CLA甘油酯尚未見相關報道。SC-CO2狀態(tài)下酶反應，是近年來生物工程新開拓的領域[7]。當CO2達到臨界溫度(31.1℃)和壓力(7.28MPa)以上時，CO2顯示出較大的溶解能力和較高傳遞特性，從而可大大降低酶反應過程的傳質阻力，提高酶反應速率[8]；另外，SC-CO2無毒、不可燃、化學惰性佳、易與反應物底物分離[9]。這些優(yōu)點和特點使其在食品工業(yè)上的應用具有廣闊的發(fā)展前景。本實驗以CLA和甘油為原料，對超臨界狀態(tài)下酶法合成CLA甘油酯進行研究，探討反應壓力、溫度、時間、底物物質的量比、分子篩添加量和酶用量對酯化率的影響，為工業(yè)生產(chǎn)中有效獲得CLA甘油酯提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共軛亞油酸(80%) 青島澳海有限公司；CLA標準品 美國Sigma公司；Novozym 435脂肪酶(酶活1340U/g)丹麥若維信公司；甲醇(色譜純)、甘油(分析純)、正己烷(色譜純)、氫氧化鉀(分析純)、3A分子篩 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SHA-CA水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；高壓反應釜 江蘇太倉市醫(yī)療器械廠；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；高速離心機 北京醫(yī)藥公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；AR2140電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促酯化的方法

在反應釜中按3:1的物質的量的比加入CLA與甘油，同時加入轉子和一定量的脂肪酶、分子篩，將反應釜密封后充入少量CO2以置換出反應釜中的空氣，同時試漏，確定反應釜密封情況良好后，在加壓泵的作用下充入CO2使反應釜內達到一定壓力，然后將反應釜置于水浴鍋中，調節(jié)轉速至100r/min，在一定溫度下反應一定時間。

1.3.2CLA的測定與分析

取1.3.1節(jié)中液體產(chǎn)物3～5滴，稱質量，采用無水硫酸鈉過濾除去水分，以體積分數(shù)1% H2SO4-甲醇甲酯化[10]后溶于正己烷，供氣相色譜分析。CLA的含量通過利用CLA標準品繪制的標準曲線算出。

氣相色譜分析方法參考Eulitz等[11]的方法。

1.4CLA酯化率計算

式中：C0為反應初始體系中CLA的單位含量(g/g)；Ct為反應完畢后體系的游離CLA的單位含量(g/g)。

1.5 甘油酯的純化

反應完畢后，取出轉子，將反應釜內的物質在高速離心機的作用下離心除去固定化脂肪酶、分子篩和水。取上述物質溶于正己烷中，加入酚酞指示劑，用0.1mol/L KOH-乙醇滴定，直至出現(xiàn)粉紅色。加水洗分層，取上層旋轉蒸發(fā)除去殘存的溶劑[12]，得到共軛亞油酸甘油酯。

2 結果與分析

2.1 反應條件對CLA酯化率的影響

2.1.1 分子篩添加量對CLA酯化率的影響

分子篩添加量分別為2%、4%、6%、8%和10% (質量分數(shù))時，酶用量2%(質量分數(shù))、反應壓力8MPa、反應溫度50℃、反應時間15h，分子篩添加量對CLA酯化率的影響見圖1。

圖1 分子篩添加量對CLA酯化率的影響Fig.1 Effect of type 3A molecular sieve amount on CLA esterification

由圖1可知，分子篩添加量對CLA酯化率的影響較顯著。CLA酯化率隨著分子篩添加量的增加而提高，這主要是由于CLA與甘油反應的副產(chǎn)物水分子能夠及時被分子篩吸收，反應才能夠持續(xù)向正向進行。當分子篩添加量達到6%時，CLA的酯化率為69.37%，分子篩用量繼續(xù)增加時，CLA酯化率的提高并不顯著，反而有下降的趨勢。這可能是由于酶反應主要在環(huán)繞著酶分子的水層內進行，底物分子必須先進入微水相，才能與酶作用，激發(fā)酶的活性[13]，當分子篩添加量過高時，體系中的水分子被分子篩吸收的過多，反而不利于酶反應的進行。因此分子篩添加量為6%較為適宜。

2.1.2 酶用量對CLA酯化率的影響

酶用量分別取1%、2%、3%、4%和5%時，分子篩添加量6%、反應壓力8MPa、反應溫度50℃、反應時間15h，酶用量對CLA酯化率的影響見圖2。

圖2 酶用量對CLA酯化率的影響Fig.2 Effect of Novozym 435 lipase on CLA esterification

在超臨界高壓下，脂肪酶活力基本不受影響[14]。隨著酶用量的增加CLA的酯化率也隨之提高，但當酶用量達到3%以上時，CLA酯化率的增加趨勢并不明顯，這可能是由于酶用量過高時催化反應速率加快，分子篩用量相對不足，不能吸收產(chǎn)生的水分子，導致反應不能及時向正向進行。同時脂肪酶價格較高，出于成本考慮，酶用量選擇3%最為適宜。

2.1.3 反應壓力對CLA酯化率的影響

反應壓力分別取8、9、10、11、12MPa時，分子篩添加量6%、酶用量3%、反應溫度50℃、反應時間15h，反應壓力對CLA酯化率的影響見圖3。

圖3 反應壓力對CLA酯化率的影響Fig.3 Effect of pressure on CLA esterification

由圖3可知，壓力對脂肪酶本身體系影響不大，主要是它影響了SC-CO2的性質，從而影響反應速率及酯化率[15]。一般隨著反應壓力的增加，反應速率加快，從而可相應縮短反應時間，當壓力達到11MPa以上時，CLA酯化率的提高并不明顯，因此反應壓力11MPa較為適宜。

2.1.4 反應溫度對CLA酯化率的影響

反應溫度分別取40、50、60、70、80℃時，分子篩添加量6%、酶用量3%、反應壓力11MPa、反應時間15h，反應溫度對CLA酯化率的影響見圖4。

圖4 反應溫度對CLA酯化率的影響Fig.4 Effect of temperature on CLA esterification

由圖4可知，當溫度從40℃升至60℃時，CLA的酯化率隨之逐漸上升，這說明隨著溫度的升高脂肪酶的催化活性部位逐漸暴露，發(fā)揮出較強的活性。當溫度達到60℃時，脂肪酶催化活性達到極值，之后酯化程度開始下降，這有可能是由于較高溫度致使酶部分失活而引起的?？梢姡琋ovozym 435在催化酯化反應的最佳溫度在60℃左右。

2.1.5 反應時間對CLA酯化率的影響

反應時間分別取5、15、25、35、45h時，分子篩添加量6%、酶用量3%、反應壓力11MPa、反應溫度60℃，反應時間對CLA酯化率的影響見圖5。

圖5 反應時間對CLA酯化率的影響Fig.5 Effect of reaction time on CLA esterification

催化酯化反應過程中，Novozym 435通常所需時間較長，多在24～48h，但反應時間過長會直接影響酶的活力和重復利用。由圖5可知，隨著反應時間的延長，CLA的酯化率不斷提高，但當反應時間達到25h后上升效果并不顯著，這是因為隨著反應時間延長，底物濃度和酶活力開始降低，反應速度逐漸減小，酯化率的增長趨于平緩，體系基本達到平衡。綜合考慮反應時間以25h為宜。

2.2 最佳工藝參數(shù)的確定

表1 CLA酯化反應正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 CLA酯化反應正交試驗設計及結果Table 2 Scheme and experimental result of orthogonal array design

在單因素試驗基礎上，保持反應壓力11MPa，選擇分子篩用量、酶用量、反應溫度和反應時間設計四因素三水平正交試驗(每一組合中安排了3次重復試驗)，從而優(yōu)化超臨界CO2狀態(tài)下酶法合成CLA甘油酯的反應條件。

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis for CLA esterification

由表2極差分析結果可知，各因素對CLA酯化率影響的主次順序為分子篩添加量＞酶用量＞反應溫度＞反應時間。由正交試驗結果的直觀分析可知，最優(yōu)組合為A2B3C2D1，即反應條件為分子篩添加量6%、酶用量4%、反應溫度60℃、反應時間20h。

由表3方差分析結果可知，A因素在α=0.1水平顯著，D因素SS值相對較小，可作為誤差項，由于沒有交互作用，故為加性模型，即A、B與C的好水平組合表現(xiàn)一定好，因而可由直觀分析判斷有A2B3C2參加的處理表現(xiàn)一定好于其他處理。

由于正交試驗中無此組合，因最佳提取工藝不包含在正交試驗設計表內，為了進一步驗證結論的準確性，進行了驗證實驗。結果證明此條件下CLA的酯化率可達到90.98%。

2.3 共軛亞油酸的GC分析

圖6 CLA標準品的GC圖Fig.6 GC chromatography of CLA standard

圖7 CLA甘油酯的GC圖Fig.7 GC chromatography of CLA glyceride

CLA標準品、CLA甘油酯中脂肪酸組成情況的GC分析結果如圖6、7。

由圖6可知，在CLA標準品中，具有生理活性的CLA異構體，即9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分別為49.34%和48.74%，保留時間分別為46.803min和47.316min。在反應產(chǎn)物的GC圖(圖7)中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA分別在46.818min和47.342min時出現(xiàn)，含量分別為37.79%和41.66%，即反應產(chǎn)物的脂肪酸組成中，具有生理活性的脂肪酸含量高達79.45%。

3 結 論

在超臨界CO2狀態(tài)下酶法制備CLA甘油酯，通過單因素和正交試驗的研究，確定最佳的制備工藝：分子篩添加量6%、酶用量4%、反應溫度60℃、反應時間20h、反應壓力11MPa，結果表明，此條件下CLA的酯化率可達到90.98%。CLA甘油酯的脂肪酸組成中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分別為37.79%和41.66%。此方法產(chǎn)生的CLA甘油酯屬天然，綠色的結構脂質，能夠滿足特殊人群對CLA的需求。

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Preparation of Conjugated Linoleic Acid Glyceride by Direct Esterification under Supercritical Carbon Dioxide

LI Mo-xin，LIU Jing，ZHOU Xiao-dan，GAO Yu-wei，YU Dian-yu*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The lipase-catalyzed preparation of conjugated linoleic acid glyceride (CLA) from conjugated linoleic acid and glycerin under supercritical CO2was studied. The effects of the quantities of molecular sieve and enzyme addition, pressure, temperature and time on the esterification rate of CLA were investigated. The results showed that the optimal parameters for preparing CLA were as follows: in the attendance of 6% type 3A molecular sieve and 4% Novozym 435 lipase, reaction at 60 ℃ and 11 MPa for 20 h. Under these conditions, the esterification rate of CLA reached 90.98%. The contents of 9c,11t-CLA and 10t,12c-CLA was 37.79% and 41.66%, respectively in the CLA glyceride prepared.

supercritical CO2；conjugated linoleic acid (CLA)；glyceride；esterification rate of CLA

TS229

A

1002-6630(2011)08-0029-04

2010-10-17

國家“863”計劃項目(2010AA101503)

李默馨(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：moxin89152936@163.com

*通信作者：于殿宇(1964—)，男，教授，碩士，研究方向為大豆加工技術。E-mail：dyyu2000@yahoo.com.cn