馬 旭，王巖峰，安貴峰，商冠寧，呂 剛

(1.沈陽市骨科醫(yī)院，遼寧 沈陽 110044；2.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 骨科，遼寧 沈陽 110001)

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，惡性度高，預(yù)后差，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來的研究表明，S100A4基因和蛋白的異常表達(dá)與惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，特別在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。S100A4有可能成為一種能夠預(yù)測腫瘤病情發(fā)展及指導(dǎo)臨床治療的指標(biāo)。本研究檢測S100A4基因在不同的人骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS購自中科院上海細(xì)胞研究所。骨肉瘤組織選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004-2008年收治的骨肉瘤病例33例，對照組選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2008年收治的骨軟骨瘤病例13例。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃, 5 % CO2，DMEM/HIGH Glucose培養(yǎng)基+10 %標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取和Real-time PCR反應(yīng)：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Real-time PCR反應(yīng)引物序列，目的基因S100A4：5'-GCCCTGGATGTGATGGTG-3'(上游)，5'-CGTTGTCCCTGTTGCTGT-3'(下游)，擴(kuò)增產(chǎn)物184 bp；內(nèi)參照β-actin：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'(上游)，5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'(下游)，擴(kuò)增產(chǎn)物150 bp。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃，5 s(1次)；95 ℃，5 s；56 ℃，20 s；68 ℃，15 s(循環(huán)45次)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL于含0. 5 μg/mL EB的2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.3 SP法免疫組化染色：石蠟切片，3 μm厚，脫蠟水化后進(jìn)行免疫組化染色。用枸緣酸鹽緩沖液(pH 6.0)高溫修復(fù)抗原；用3 %過氧化氫室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的活性；正常山羊血清室溫封閉10 min；加入1∶100稀釋的兔抗人S100A4多克隆抗體(NeoMarkers)/鼠抗人CD44V6單克隆抗體(Maixin)后，37 ℃溫箱孵育150 min；滴加適當(dāng)生物素化二抗工作液，37 ℃孵育20 min；滴加S-P液(ZYMED)，37 ℃孵育20 min；最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染5 min，1 %鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗反藍(lán)；切片經(jīng)過梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)替代一抗作為陰性對照。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

S100A4蛋白陽性表達(dá)的位置在骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，CD44V6蛋白陽性表達(dá)的位置在骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和近膜的胞漿，陽性細(xì)胞著色呈不同程度的黃色。每張切片分別計數(shù)5個不連續(xù)的高倍視野，計算平均陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比。按染色程度將陽性信號分為3 類：淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為每例組織染色的綜合記分。陽性表達(dá)為綜合記分≥1，陰性表達(dá)為<1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MG-63人骨肉瘤細(xì)胞呈圓形、多角形和梭形等多種形態(tài)。傳代后3 h左右即可見細(xì)胞相繼貼壁生長，8 h后細(xì)胞逐漸伸出胞突，變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形， 24 h后見有較多新分裂的細(xì)胞附著于集落表面，核仁多個，為圓形或不規(guī)則形。U-2OS人骨肉瘤細(xì)胞呈圓形、扁平不規(guī)則多角形和短梭形等多種形態(tài)，中央有圓形核，上皮型細(xì)胞形態(tài)明顯。細(xì)胞的體積小于MG-63細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜狀。

2.2 Real-time PCR反應(yīng)結(jié)果

Real-time PCR反應(yīng)結(jié)果顯示，人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS中均有S100A4基因表達(dá)。用瓊脂糖凝膠電泳定性檢測PCR產(chǎn)物。顯示骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS中均有100～250 bp之間的清晰條帶，表達(dá)程度接近；同時擴(kuò)增兩種骨肉瘤細(xì)胞系的管家基因β-actin，表達(dá)程度也相近，片段小于S100A4基因。由于擴(kuò)增的S100A4基因為184 bp的片斷，且骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS中均有100～250 bp之間的清晰條帶(圖1)，兩種細(xì)胞系均有S100A4基因的表達(dá)。管家基因β-actin的擴(kuò)增片段的大小是150 bp，并且在各種細(xì)胞中表達(dá)程度相似。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

S100A4蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)的陽性率是69.7%，陽性表達(dá)的位置在骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，呈棕褐色顆粒狀陽性反應(yīng)(圖2a)，對照組未見S100A4蛋白表達(dá)。CD44V6蛋白陽性表達(dá)的位置在骨肉瘤和骨軟骨瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和近膜的胞漿，呈棕黃色陽性反應(yīng)(圖2b、c)，在骨肉瘤組織中表達(dá)的陽性率是60.6%，在骨軟骨瘤中的陽性率僅為7.7%。

圖1 Real-time PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 S100A4蛋白與CD44V6蛋白表達(dá)的關(guān)系

本實驗檢測的骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6蛋白的表達(dá)有一致性，經(jīng)配對樣本t檢驗分析顯示S100A4和CD44V6蛋白的表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.413，P<0.05，表1)。

圖2 S100A4和CD44V6蛋白在骨肉瘤組織中的的表達(dá) SP ×400

表1 S100A4和CD44V6蛋白在骨肉瘤中表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

骨肉瘤是臨床常見的成骨性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20 %，其惡性程度高，好發(fā)于青少年，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)水平的提高，尤其是腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制在分子水平上有了新的認(rèn)識。近年來的研究表明，S100A4基因和蛋白的異常表達(dá)與惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，特別在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。有關(guān)S100A4蛋白與多種腫瘤生物學(xué)特性的研究已相繼開展。

S100A4基因是1989年由Sbralidze從高轉(zhuǎn)移性小鼠乳癌細(xì)胞中克隆出來的一種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[3]。1992年克隆了人類S100A4基因。該基因位于染色體1q21，基因全長2837 bp，編碼101個氨基酸的蛋白。該區(qū)易發(fā)生各種染色體的缺失、易位、重疊等改變，提示S100A4基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。關(guān)于S100A4基因與腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制的最初證據(jù)來源于對具有轉(zhuǎn)移性的鼠細(xì)胞系SR-3Y1的觀察[5]。其后的轉(zhuǎn)染實驗顯示,嚙齒動物及人類的S100A4可以誘導(dǎo)無轉(zhuǎn)移性的大鼠乳腺癌細(xì)胞系出現(xiàn)轉(zhuǎn)移征象[6]。與此相似的，將嚙齒動物S100A4基因轉(zhuǎn)染入鼠類惡性黑素瘤細(xì)胞系B16和人類乳腺癌細(xì)胞系MCF7增加了其向肺臟轉(zhuǎn)移的能力[7]。上述研究揭示了S100A4基因與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移行為之間的關(guān)系，驗證了S100A4基因的促腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS中，均有S100A4基因的表達(dá)，mRNA的含量相近，說明S100A4基因在不同人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS中的表達(dá)程度相近。因此，推測S100A4基因與骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為進(jìn)一步的研究提供了依據(jù)。

CD44(cluster of differentiation 44)是1980年被發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)，由單一基因編碼的具有高度異質(zhì)性的單鏈膜表面糖蛋白家族，可與多種配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附作用[8]。人類CD44基因定位于11號染色體短臂(11p13)，長50～60 kb，由兩組外顯子(1～20)組成。一組編碼普遍表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)型CD44s；另一組稱為變異體CD44V。含有變異型外顯子V6編碼序列的CD44分子，即為CD44V6，與人類腫瘤關(guān)系密切。研究表明，CD44V6在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)或發(fā)生構(gòu)型改變 ，即在腫瘤組織中呈高表達(dá)，而在正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)。臨床研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，CD44V6的過量表達(dá)與骨肉瘤、乳腺癌、胃腸道腫瘤、子宮頸癌和淋巴瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移以及手術(shù)后生存期長短密切相關(guān)。Shiratori等[11]對骨肉瘤細(xì)胞株(POS-1)轉(zhuǎn)染的20只鼠肺轉(zhuǎn)移情況研究證實，CD44V6的上調(diào)能促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移；Khan等[12]的研究也證實，上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面CD44V6的表達(dá)，能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

在本研究中，S100A4和CD44V6蛋白在選取的骨肉瘤組織中均有比較高的表達(dá)，而在對照組骨軟骨瘤中沒有表達(dá)或僅有少量的表達(dá)。據(jù)此可推測，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與S100A4和CD44V6蛋白的異常表達(dá)有密切的關(guān)系。S100A4蛋白可以降低腫瘤細(xì)胞間粘附力、增加腫瘤細(xì)胞的運動能力、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞異常增生和促進(jìn)新生血管生成。而CD44V6蛋白通過下面幾種方式影響腫瘤細(xì)胞：介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管或小靜脈中的高內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，使淋巴細(xì)胞穿過血管壁，并參與淋巴細(xì)胞的激活過程；與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原蛋白、纖維蛋白、層黏蛋白等基質(zhì)結(jié)合；與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合參與細(xì)胞偽足形成而參與細(xì)胞的遷移運動。本研究還發(fā)現(xiàn)，檢測的骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6蛋白的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示S100A4和CD44V6的表達(dá)可能有內(nèi)在聯(lián)系。由此推測，S100A4和CD44V6可能通過對細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用而發(fā)生相互影響，降低細(xì)胞間粘附力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過調(diào)控這些基因的表達(dá)，可能使骨肉瘤的生長、轉(zhuǎn)移受到抑制，為骨肉瘤的治療提供了新的思路。

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