楊建華，王 蕾，周世廣，劉春海，瞿 峰，時志民，孫冬霞

(1. 邯鄲市中心醫(yī)院 病理科, 河北 邯鄲 056004；2. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056002)

近年來，許多研究認為腫瘤實際是一種細胞周期病，即細胞周期啟動、運行和終止異常，細胞增殖過多，凋亡減少，腫瘤形成。在細胞周期中G1-S是控制細胞周期進程的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因為在G1期中存在一限制點(restriction point，R點)。在R點之前，細胞周期的運行依賴于細胞外生長因子，而一旦細胞周期跨過R點，細胞周期即為一自主性的過程，不再依賴于外界生長因子，所以G1-S對于細胞周期的運行和完成是至關(guān)重要的[1-2]。其中，核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1、P27對調(diào)節(jié)細胞由G1期進入S期起著至關(guān)重要的作用。本研究采用免疫組化SP法檢測人大腸癌中E2F-1和P27的表達，探討兩者與大腸癌的臨床病理關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 組織標本

收集選取2006年1月-2010年12月在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院進行大腸癌根治性切除經(jīng)病理確診的大腸癌78例，所有病例根治性手術(shù)前均未行化療或放療。78例患者中，男53例，女25例；年齡39～79歲，平均(59.3±20.3)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴轉(zhuǎn)移35例。按WHO分類標準(1996)進行組織學(xué)分級：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年修訂的TNM分期標準進行分期。同時取同期手術(shù)切除和結(jié)腸鏡活檢并經(jīng)病理確診的大腸腺瘤30例，另取癌旁10 cm以上正常大腸黏膜20例作為對照組。

1.2 方 法

試劑：兔抗人E2F-1多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，鼠抗人單克隆抗體P27和即用型S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司。

步驟：采用免疫組化SP法，玻片經(jīng)多聚賴氨酸行防脫片處理，微波抗原修復(fù)。染色過程按試劑盒說明操作。

1.3 結(jié)果判斷

切片免疫組化染色以已知陽性的肺癌為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。染色均以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，兩名病理醫(yī)生在顯微鏡下計數(shù)10個高倍視野，按陽性細胞所占百分比并參考著色強度分級如下：(-)：陽性細胞數(shù)<10%；(+)：陽性細胞數(shù)10%～24%；(++)：陽性細胞數(shù)25%以上。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組間比較用χ2檢驗，應(yīng)用非參數(shù)統(tǒng)計中Spearman等級相關(guān)對E2F-1和P27在大腸癌中表達的相互關(guān)系進行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 E2F-1和P27在大腸癌中的表達

E2F-1和P27陽性物質(zhì)分布于細胞核，見圖1、2。大腸癌E2F-1陽性表達率明顯高于正常大腸黏膜和大腸腺瘤(P<0.05)，正常大腸黏膜和大腸腺瘤E2F-1陽性表達率差異無顯著性意義(P>0.05)；P27在正常大腸黏膜中的陽性表達率明顯高于大腸腺瘤以及大腸癌，P27陽性表達在正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌之間差異具有顯著性意義(P<0.05)，見表1。

圖1 大腸腺癌中E2F-1呈細胞核陽性表達 SP ×400

圖2 大腸腺癌中P27呈細胞核陽性表達 SP ×400

表1 正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌中E2F-1、P27的表達

2.2 大腸癌組織中E2F-1和P27表達與臨床病理指標之間的關(guān)系

在大腸癌組織中，E2F-1和P27的表達與患者的性別、年齡、大小無明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。但E2F-1和P27表達與大腸癌的病理分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。且隨著病理分級、臨床分期的增高，E2F-1表達逐漸增高而P27表達降低，見表2。

2.3 大腸癌組織中E2F-1與P27表達的關(guān)系

對大腸癌組織中E2F-1與P27表達水平進行相關(guān)性分析，E2F-1陽性表達的48例大腸癌中，2例P27陽性表達,E2F-1與P27表達呈顯著負相關(guān)(P<0.01,r= -0.393)。

表2 大腸癌組織中E2F-1、P27的表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

大腸癌的發(fā)生是一個漸進過程。它經(jīng)歷了正常大腸黏膜-上皮增生-腺瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級-不典型增生-原位癌-大腸癌-轉(zhuǎn)移的演進過程。早期階段主要是細胞過度增生，進一步發(fā)生細胞增生調(diào)控紊亂，最終導(dǎo)致早期癌和轉(zhuǎn)移，目前尚不清楚是哪些基因在腫瘤進展的哪個階段發(fā)生突變或失調(diào)。但是，研究確定在G1期中存在一限制點(restriction point,R點)。一旦細胞周期跨過R點，細胞周期即為一自主性的過程，不再依賴于外界生長因子，所以G1-S對于細胞周期的運行和完成至關(guān)重要[1-2]。其中，核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1對調(diào)節(jié)細胞由G1期進入S期起著至關(guān)重要的作用，轉(zhuǎn)錄因子E2F-1可與DP蛋白家族(DP1和DP2)結(jié)合形成異二聚體，增強其轉(zhuǎn)錄活性；也可與Rb結(jié)合形成異二聚體，抑制其轉(zhuǎn)錄活性[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，E2F-1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了復(fù)雜的作用，起到癌基因或抑癌基因的作用。在食管鱗狀細胞癌、胃癌和涎腺腫瘤中均可見到E2F-1的過度表達[4-7]。在小細胞肺癌，E2F-1可以作為一種生長促進因子，促進腫瘤增殖，是預(yù)后不好的指標[8]。但是，也有一些實驗結(jié)果卻表明[9-11]，E2F-1的過表達可以終止細胞的過度增生和誘導(dǎo)細胞凋亡，起到抑癌基因的作用[12]。

作者在對人大腸石蠟標本研究中發(fā)現(xiàn)，E2F-1更多的表現(xiàn)為癌基因的作用。在正常大腸黏膜、大腸腺瘤以及大腸癌中E2F-1蛋白陽性表達逐漸增高。在大腸癌組中E2F-1蛋白的陽性表達率明顯高于正常組和大腸腺瘤組。由此推斷在大腸癌的發(fā)生過程中，E2F-1過表達起到了促進作用。同時，在大腸癌組織中，E2F-1陽性表達與大腸癌的組織分級、臨床病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。且隨著大腸癌組織分級和臨床病理分期增高，E2F-1表達也逐漸增強，表明E2F-1的過表達在一定程度上可以反映大腸癌的生物學(xué)特性，其表達水平越高，腫瘤的侵襲力越強，惡性度就越高。

p27 是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 (cyclin - dependent kinase inhibitors,CKI)家族中的重要一員，是一種抑癌基因，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有該蛋白水平下降[13]。p27可直接抑制cyclin - CDK復(fù)合物的生物學(xué)活性，使細胞停滯于G1期，同時具有促進細胞分化、介導(dǎo)細胞間黏附及誘導(dǎo)凋亡等功能[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，P27從正常大腸黏膜到大腸腺瘤到大腸癌中表達逐漸下降，提示P27在大腸癌的發(fā)生中可能起重要作用。本實驗研究亦發(fā)現(xiàn)P27蛋白表達與大腸癌的分化程度、浸潤深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。P27蛋白水平在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤轉(zhuǎn)移時降低，提示P27蛋白表達率降低的大腸癌更易發(fā)生淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移和肌層浸潤。故認為P27低表達是大腸癌預(yù)后不良的一個獨立指標。P27蛋白表達與腫瘤的惡性程度負相關(guān)，可能為P27的低表達時，對G1/ S期轉(zhuǎn)換的抑制作用減弱，使細胞更易進入S期；P27表達能影響細胞間接觸，下調(diào)P27能抑制細胞粘附從而促進腫瘤細胞擴散。

此外，本研究對E2F-1與P27相關(guān)性進行分析發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，E2F-1的高表達伴隨著P27低表達，二者呈負相關(guān)；也說明二者在大腸癌中分別起著癌基因和抑癌基因的作用。

總之，在大腸癌組織中E2F-1過度表達以及P27表達缺失，對大腸癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用,檢測E2F-1和P27在腫瘤組織中的表達情況可能成為評價腫瘤患者預(yù)后的重要指標。

參考文獻：

[1] Zetterberg A, Larsson O, Wiman K G. What is the restriction point? [J].Curr Opin Cell Biol, 1995, 7 (6): 835-842.

[2] Blagosklonny M V, Pardee A B. The restriction point of the cell cycle[J]. Cell Cycle, 2002, 1 (2): 103-110.

[3] Wu Z, Zheng S, Yu Q. The E2F family and the role of E2F1 in apoptsis[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41 ( 12 ) :2389-2397.

[4] 伍宏彪,吳巨鋼,張鵬,等. 胃癌進展中轉(zhuǎn)錄因子e2f -1的表達變化及其意義[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志[J].2010,6(17):573-580.

[5] Etges A, Nunes FD, Ribeiro KCB, et al. Immunohistochemical expression of retinoblastoma pathway proteins in normal salivaryglands and in salivary tumors[J]. Oral Oncol,2004,40(3):326-331.

[6] Yamazaki K, Hasegawa M, Ohoka I, et al. Increased E2F-1 expression via tumor cell proliferation and decreased are correlated with adverse prognosis in patients with squamous cell cancer of the oesophagus[J]. J Clin Pathol,2005,58(9):904-910.

[7] Ebihara Y, Miyamoto M, Shichinohe T et al. Over-expression of E2F-1 in esophageal squamous cell cancer correlates with tumor progression[J].Dis Esophagus,2004,17(2):150-154.

[8] Gorgoulis VG, Zacharatos P, Mariatos G,et al. Inhibition of aldose reductase prevents growth factor induced G1-S phase transition through the AKT/Phosphoinositide 3-Kinase/E2F-1 pathway in human colon cancer cells[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9(4):813-824.

[9] Hao H, Chen C, Rao XM,et al. E2F-1- and E2Ftr-mediated apoptosis: the role of DREAM and HRK[J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(11):4930-4934.

[10] Gomez-Gutierrez JG, Garcia-Garcia A, Hao H,et al. Adenovirus-mediated expression of truncated E2F-1 suppresses tumor growth in vitro and in vivo[J]. Cancer,2010,116(18):4420-4432.

[11] Mary JE,Yan Bin D,Hailing Y,et al.E2F-1 Up-Regulates c-Myc and p14ARF and induces apoptosis in colon cancer cells[J].Clin Can Res,2001,7(11):3590-3597.

[12] Zacharatos P,Kotsinas A, Evangelou K,et al.Distinct expression patterns of the transcription factor E2F-1 in relation to tumour growth parameters in common human carcinomas[J].J Pathol,2004,203(3)：744-753.

[13] Ana BQ, Gustavo F, Cristine D, et al. Expression of P27, p21WAF/Cip1 and p16INK4a in normal oral epithelium, oral squamous papilloma, and oral squamous cell carcinoma [J]. Anticancer Res, 2010，30(7): 2799-2803.

[14] Li O, Antonio M F, Steve O,et al. Incomplete folding upon binding mediates Cdk4/Cyclin D complex activation by tyrosine phosphorylation of inhibitor P27 protein [J]. J Biol Chem, 2011，286(26): 30142-30151.