金 越，韓國柱，李 穎，馬郁芳，周 琴，孫慧君

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥理教研室，遼寧 大連，116044； 2. 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 臨床藥理教研室，遼寧 大連 116044； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 遼寧 大連 116044)

腦組織代謝旺盛，血流量豐富，因此極易受到缺血缺氧的影響，引起神經(jīng)細(xì)胞功能的損害[1]。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是由于腦部血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致以局部神經(jīng)功能損傷、缺失為特征的一組疾病[2]。該病死亡率高，并發(fā)癥和后遺癥多，嚴(yán)重危害人類健康，目前仍然缺乏有效的防治措施與理想藥物。

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是人體內(nèi)自有的活性物質(zhì)，作為體內(nèi)能量儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體，為ATP補(bǔ)充能量，維持機(jī)體進(jìn)行正常的活動(dòng)和代謝[3]。PCr于1927年由Eggleton 于哺乳動(dòng)物肌肉中分離得到，目前外源性PCr在臨床上主要作為心臟病的防治用藥之一廣泛用于心肌保護(hù)，但是其對腦損傷的保護(hù)作用以及機(jī)制研究鮮見報(bào)道。本文主要通過建立小鼠腦缺血與腦缺血再灌注模型以及建立大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型來研究PCr對腦組織以及神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

PCr注射用無菌粉針劑，內(nèi)含磷酸肌酸鈉1g/支，哈爾濱博萊制藥有限公司惠贈(zèng)(批號070823，純度>97%)；肌酸由美國MERCK公司生產(chǎn)，純度≥99%。

Hyclone胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、二甲基四氮唑藍(lán)(MTT)購自Gibco公司；Hyclone馬血清購自Thremo公司；連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)購自天津市化學(xué)試劑公司；LDH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；青霉素、鏈霉素購自大連制藥廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)對象與儀器

動(dòng)物與細(xì)胞株：昆明種小鼠共120只，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。儀器：3366型CO2培養(yǎng)箱，Thermo-354酶標(biāo)儀，XD-101倒置顯微鏡，80-1型低速離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦缺血小鼠生存時(shí)間以及腦組織MDA含量的測定：小鼠60只，體重20～30 g，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及藥物組。每組各20只。藥物組于造模前5 min緩慢尾靜脈推注PCr(10 mL/kg)，假手術(shù)組與模型組以同樣方法注射同等體積的生理鹽水。

小鼠腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)。麻醉后，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈。藥物組及模型組雙重置線結(jié)扎兩側(cè)血管，假手術(shù)組只在血管下置線并不結(jié)扎?？p合皮膚切口，將小鼠置于37 ℃恒溫環(huán)境加以護(hù)理。觀察動(dòng)物4 h內(nèi)反應(yīng)及死亡情況。

待小鼠瀕死時(shí)(小鼠呼吸<5 次/min視為瀕死)及手術(shù)后4 h記錄存活時(shí)間并在冰浴中活體斷頭取腦(去除嗅球及小腦組織)，在-70 ℃冰箱凍存待測。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在冰浴中用預(yù)冷的生理鹽水將腦組織配制成20%腦勻漿，4 ℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行MDA含量測定(硫代巴比妥酸比色法)。

1.3.2 腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的測定：小鼠60只，體重20～30 g，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組以及藥物組。每組20只。小鼠腹腔注射25%烏拉坦(1 g/kg)，麻醉后，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈。藥物組緩慢尾靜脈推注PCr(10 mL/kg)，假手術(shù)組與模型組以同樣方法注射同等體積的生理鹽水。

給藥后8 min，藥物組及模型組分別夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組不夾閉動(dòng)脈。30 min后取下微型動(dòng)脈夾，再灌注30 min后立即冰浴中活體斷頭取腦(去除嗅球及小腦組織)，在-70 ℃冰箱凍存待測。MDA測定方法同上。

1.3.3 PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型MTT和LDH含量測定：PC12細(xì)胞用高糖DMEM完全培養(yǎng)基(內(nèi)含10%滅活胎牛血清、5%馬血清、青霉素/鏈霉素100 U/mL)置于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況， 2～3 d換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞80%匯合或接近匯合成片后，用0.05%胰蛋白酶消化并用吸管輕輕吹打收集細(xì)胞，每周傳代2次。

取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，消化離心后用完全培養(yǎng)基重懸，密度為2×105個(gè)/mL，接種于96 孔板上。在37 ℃, 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕蕩洗2次。

實(shí)驗(yàn)分為正常組，缺氧缺糖模型組，藥物組(PCr組以及肌酸組)。正常組細(xì)胞用含糖Earle’s液 (g/L) (NaCl 6.68，KCl 0.04，CaCl20.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaHCO32.2，NaH2PO4·2H2O 0.4，HEPES 2.4，葡萄糖0.2，pH 7.4) 培養(yǎng)。模型組細(xì)胞用含4 mmol/L Na2S2O4的無糖Earle’s液(配置方法同上，但不加葡萄糖)進(jìn)行培養(yǎng)(各損傷小組的Na2S2O4的濃度分別為0.5、1、2、4、8 mmol/L)。藥物組細(xì)胞用含4 mmol/L Na2S2O4以及不同濃度藥物的無糖Earle’s液進(jìn)行培養(yǎng)，藥物終濃度分別為20、15、10、8、5、1 mmol/L。將培養(yǎng)板置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后回收上清液，并加無血清高糖DMEM液100 μL/孔，MTT(終濃度0.5 mg/mL) 10 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入三聯(lián)液(10%SDS，5%異丙醇，0.012 mol/L HCl)100 μL/孔，待紫色結(jié)晶完全溶解后，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm波長處測定A值。藥物抑制率=(A藥物組-A模型組) /(A正常組-A模型組) ×100%。用LDH試劑盒測定上清液中LDH的釋放量，測定方法依照LDH試劑盒說明書上操作，于440 nm處測定A值。LDH含量按公式計(jì)算：LDH (U/L)=(A測定-A測定空白) /(A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)空白) ×2000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PCr對腦缺血小鼠生存時(shí)間以及腦組織MDA含量的影響

藥物組小鼠與模型組小鼠相比存活時(shí)間明顯延長，腦組織MDA含量下降，其小鼠腦組織MDA水平與模型組相比差異具有顯著性意義，P<0.05。見表1。

2.2 PCr對腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響

如表1所示，在缺血再灌注模型中，藥物組小鼠腦組織MDA含量下降，與模型組小鼠腦組織MDA的水平相比差異具有顯著性意義，P<0.05。

表1 PCr對腦缺血小鼠生存時(shí)間及對腦缺血/腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響

2.3 PCr對PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型的影響

2.3.1 Na2S2O4致PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷作用

Na2S2O4濃度為 1、2、4及8 mmol/L時(shí)的損傷程度與正常組相比，差異有顯著性意義。見表2。細(xì)胞培養(yǎng)液中的Na2S2O4濃度達(dá)到4 mmol/L及以上時(shí)，MTT法測得的細(xì)胞存活率顯著降低，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH 釋放量顯著上升，故確定4 mmol/L Na2S2O4為實(shí)驗(yàn)所用的損傷濃度。

表2 不同濃度Na2S2O4對PC12細(xì)胞損傷作用的比較

2.3.2 PCr和肌酸對PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用

由表3可見，與模型組比較，PCr和肌酸組隨藥物濃度的增加，Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷有所減輕，細(xì)胞存活率明顯提高，受損細(xì)胞LDH的釋放受到抑制。從藥物終濃度為5 mmol/L開始，藥物組與模型組相比差異有顯著性意義。藥物終濃度至10 mmol/L時(shí)，對Na2S2O4誘導(dǎo)產(chǎn)生的缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用達(dá)到高峰，繼續(xù)增加藥物濃度其保護(hù)作用沒有顯著增加。各濃度的PCr與相同濃度的陽性對照藥肌酸相比，差異無顯著性意義。

表3 PCr以及肌酸對缺氧缺糖細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

3 討 論

能量代謝障礙是腦缺氧缺血后最早產(chǎn)生的病理生理改變，隨后產(chǎn)生大量自由基并引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，促使神經(jīng)細(xì)胞趨向死亡[4]。腦組織缺氧缺血時(shí)能夠產(chǎn)生大量的氧自由基；此外，腦細(xì)胞神經(jīng)元富含對氧自由基敏感的多不飽和脂肪酸而抗氧化的物質(zhì)相對缺乏，因此極易受到自由基的侵襲傷害[5-6]，以上正是ICVD 的發(fā)病基礎(chǔ)。

興奮性毒素—谷氨酸的過度釋放是導(dǎo)致缺血缺氧性腦損傷的重要機(jī)制之一。由于谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，所以過量的情況下作用于NMDA受體和非NMDA受體，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載并激活鈣依賴的各種酶，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；鈣超載又會(huì)生成大量的ROS，促進(jìn)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，最終造成神經(jīng)元退變壞死或遲發(fā)性死亡[7]。

PCr是人體中一種高能儲(chǔ)存物質(zhì)，通過“肌酸穿梭”的機(jī)制來完成線粒體氧化磷酸化生成ATP，目前在國內(nèi)外已被廣泛用做心臟病的防治用藥之一[8-11]。腦缺血后,能量衰竭主要表現(xiàn)在高能磷酸化合物ATP、PCr的耗竭上。在缺血缺氧初期，氧化磷酸化不能正常進(jìn)行，ATP減少，糖無氧酵解的關(guān)鍵酶——磷酸果糖激酶會(huì)被激活，糖無氧酵解增加，能夠補(bǔ)充生成ATP，但是通過這種方式產(chǎn)生的ATP要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于氧化磷酸化所生成的ATP，因此最終還是會(huì)造成能量代謝紊亂，給組織細(xì)胞帶來損害。本研究證明在缺血缺氧時(shí)，內(nèi)源性PCr不能滿足機(jī)體對ATP的需求。

在機(jī)體內(nèi)，PCr主要由肌酸經(jīng)肌酸激酶催化而來。 Balestrino M等[12]發(fā)現(xiàn)，肌酸能夠有效抑制去極化引起的大鼠腦組織的缺氧缺血損傷，由此可以推測，PCr可能對缺血缺氧的腦組織也具有保護(hù)作用。目前，已有一些醫(yī)護(hù)工作者將PCr試用于臨床的腦損傷患者，并取得了一些療效[13-14]。為了切實(shí)檢測PCr的腦保護(hù)作用，本研究復(fù)制了全腦缺血以及腦缺血再灌注小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑦M(jìn)行了腦組織MDA含量的測定。MDA是自由基脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，其含量高低可以反映脂質(zhì)過氧化的水平，間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基損害的程度[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCr能夠顯著延長全腦缺血小鼠的生存時(shí)間，并降低全腦缺血與腦缺血再灌注小鼠腦內(nèi)的MDA含量，證明PCr能夠通過提高腦內(nèi)ATP水平，增進(jìn)缺血缺氧腦內(nèi)的能量代謝進(jìn)而阻止自由基的產(chǎn)生，保護(hù)腦細(xì)胞。

本研究利用Na2S2O4構(gòu)建了缺氧缺糖PC12細(xì)胞損傷模型。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞株，細(xì)胞膜上有NMDA受體、膽堿能M、N受體等，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，該細(xì)胞純化程度高、生長繁殖快、培養(yǎng)周期短、使用方便、條件易控制并有可傳代性，所以可以代替神經(jīng)細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究[16-19]。

LDH是無氧代謝的標(biāo)志性酶，廣泛存在于各組織的細(xì)胞漿內(nèi)，正常情況下不能通過細(xì)胞膜，而當(dāng)細(xì)胞受損或者死亡時(shí)，就能夠釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞的受損程度與細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性成正比[20]。故測定培養(yǎng)液中LDH活性是反映細(xì)胞損傷的一種敏感且較為簡便快捷的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖和存活狀態(tài)，LDH活性來反映細(xì)胞的損傷程度。結(jié)果表明：Na2S2O4引起的PC12細(xì)胞缺氧缺糖損傷后細(xì)胞活力降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量增加，證明細(xì)胞破損嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)PCr和肌酸均可顯著抑制PC12細(xì)胞缺氧缺糖的損傷情況,不同程度地提高受損PC12細(xì)胞的存活率并抑制LDH的釋放，并在一定范圍之內(nèi)具有劑量依賴性。當(dāng)藥物的濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，其抑制率達(dá)高峰，在此之后即使繼續(xù)增大藥物濃度，細(xì)胞的MTT值不再增加，培養(yǎng)液上清中的LDH含量也不再明顯下降，說明此時(shí)藥物的保護(hù)作用已發(fā)揮到最大。因此，本實(shí)驗(yàn)中藥物的最佳濃度為10 mmol/L，與以往國外的文獻(xiàn)報(bào)道一致[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肌酸的作用效果和PCr相近。由于肌酸是PCr的代謝產(chǎn)物，所以推測PCr的抗氧自由基作用可能與其可以代謝成肌酸有關(guān)。

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