陳娜娜，王云華，尹儉儉，李秀景，鄭叢龍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116622)

腺病毒是一種無包膜DNA病毒，作為普通的機會性病原體長期存在于人群中，具有很強傳染性。免疫功能低下的病人(如老年人、艾滋患者、免疫遺傳缺陷的患者、骨髓接受者、固體器官和造血干細胞移植者等)感染腺病毒的機率較大，在居住密集的人群，如軍隊人員中可引起急性發(fā)熱性呼吸道疾病的暴發(fā)流行[1]。腺病毒引起的急性傳染病，易侵犯呼吸道、眼結(jié)膜和淋巴結(jié)，主要表現(xiàn)為急性上呼吸道、眼部和胃腸道感染，腺病毒以其型別多、致病范圍廣而越來越受到關(guān)注，因此研發(fā)一種新的抗腺病毒藥物勢在必行。通過納米技術(shù)研制而成的納米銀(Silver nanoparticles,Silver-nps)，可以抵抗G+和G-細菌的感染，也可以對HIV、乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、猴痘病毒和單純皰疹病毒1型產(chǎn)生抑制作用[2]。但有關(guān)納米銀抗腺病毒作用及其機制研究尚未見報道。本文應(yīng)用MTT法、免疫熒光技術(shù)、透射電鏡技術(shù)和PCR方法，探討納米銀抗腺病毒的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

腺病毒3型(ADV3)：由中國科學(xué)院武漢病毒研究所提供，經(jīng)本實驗室傳代保存；人宮頸癌(Hela)細胞：由本教研室傳代保存；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)： Sigma公司，美國；二甲亞砜(DMSO)：上海生工；免疫熒光試劑盒：Dako Cytomation,UK；LATaq酶，DL2000 maker,miniBEST RNA/DNA extraction Kit： TaKaRa公司，大連；納米銀溶液：由本課題研究組應(yīng)用化學(xué)還原法制得，溶液濃度為400 μg/mL，顆粒平均粒徑約為10 nm，納米銀溶液室溫保存6個月無沉積現(xiàn)象發(fā)生。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADV3病毒毒力測定:用維持液將病毒做10倍系列稀釋，配制得10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個不同濃度的病毒液，100 μL/孔分別加入已長成單層Hela細胞的96孔培養(yǎng)板中，每個劑量設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)正常細胞對照，置37℃，5%CO2孵箱，培養(yǎng)2 h后棄掉上述液體，更換細胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每日觀察，記錄細胞形態(tài)變化，連續(xù)觀察6 d，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，吸棄培養(yǎng)板中液體,PBS沖洗3次,每孔加入MTT(5 mg/mL) 25 μL，于37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,去上清后每孔加DMSO(二甲亞砜)150 μL，微量振蕩器振蕩10 min,酶標(biāo)讀數(shù)儀(波長492 nm)測吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次，計算ADV3的半數(shù)組織感染量(TCID50)。

1.2.2 納米銀細胞毒性測定:用細胞維持液將400 μg/mL納米銀溶液2倍系列稀釋，即得：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL 7個濃度的納米銀。100 μL/孔分別加入已長成單層的Hela細胞96孔培養(yǎng)板中，每個劑量設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)溶劑對照，正常細胞對照,置37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)2 h后棄掉上述液體，更換細胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察，記錄細胞形態(tài)變化，連續(xù)觀察6 d。計算納米銀的最大無毒濃度(TC0)，方法同上。

1.2.3 不同給藥方式下納米銀對ADV3的抑制作用:(1) 納米銀對病毒增殖的抑制作用(先ADV3后納米銀) 在長成單層的HeLa細胞的96 孔板上，接種100 μL/孔的100TCID50腺病毒液，37℃ 吸附2 h，棄病毒液。在藥物無毒范圍內(nèi)加入含50 μg/mL納米銀的維持液，每孔100 μL，此濃度設(shè)5個復(fù)孔，實驗同時設(shè)正常細胞對照、ADV3對照和納米銀(50 μg/mL )對照，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)。當(dāng)ADV3病毒對照組CPE達75% 以上，MTT 法檢測細胞存活率，實驗重復(fù)3 次；(2) 對腺病毒侵入細胞的阻斷作用(先納米銀后ADV3)在藥物無毒范圍內(nèi)，預(yù)先加入含50 μg/mL納米銀維持液100 μL，作用2 h后用PBS 洗滌3次再加入100TCID50腺病毒,吸附2 h,棄病毒上清，加維持液100 μL，此濃度設(shè)5個復(fù)孔,其他同上；(3)對腺病毒直接滅活作用(ADV3和納米銀同時作用) 在藥物無毒范圍內(nèi),含50 μg/mL納米銀維持液分別與100TCID50腺病毒液等量混合,體外作用2 h后，立即加到已長成單層HeLa細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板中，37℃ 吸附2 h 后，棄去96 孔板中液體，加入維持液100 μL，此濃度亦設(shè)5個復(fù)孔，其余同上。

1.2.4 免疫熒光法檢測納米銀對ADV3的抑制作用：待Hela細胞在置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上長滿單層，將納米銀和腺病毒作如下處理后進行免疫熒光檢測：(1)先ADV3后納米銀組：預(yù)先加入100TCID50腺病毒液1 mL，吸附2 h后用PBS洗滌3次，再加入含50 μg/mL納米銀維持液1 mL/孔，吸附2 h后棄上清，加入維持液1 mL，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察CPE。實驗中同時設(shè)正常Hela細胞對照、ADV3對照、溶劑與ADV3混合作用對照組；(2)先納米銀后ADV3組：預(yù)先加入的含50 μg/mL納米銀維持液1 mL，作用2 h后用PBS洗滌3次，再加入100TC ID50腺病毒1 mL，吸附2 h，棄病毒上清，其余同上；(3)ADV3和納米銀同時作用組：將含50 μg/mL納米銀維持液與100 TCID50腺病毒液等量充分混合，室溫作用2 h后，立即加入細胞培養(yǎng)板，37℃吸附2 h后，棄去上清，其余同上。當(dāng)ADV3病毒對照組CPE達75%以上，取出各組蓋玻片用PBS洗3遍，用100%冷丙酮固定20～30 min，加screening reagent 30 μL于各個蓋玻片上，37℃作用30 min，取出用PBS沖洗3次，加anti - mouse- FITC 30 μL于各個蓋玻片上，作用37℃ 30 min，取下蓋玻片用PBS沖洗3遍，用濾紙吸干，加mounting fluid 1滴，封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 電鏡觀察不同時間納米銀對ADV3病毒粒子的破壞作用:將腺病毒液和等體積的400 μg/mL納米銀在室溫分別作用30 min、60 min、90 min、120 min、150 min后，用鑷子夾住銅網(wǎng)并浸沒于上述樣品中靜置10 min后，夾出已吸附樣品的銅網(wǎng)，將銅網(wǎng)浸沒于磷鎢酸染液(2%，pH=6.5)中靜置2～3 min，取出后用蒸餾水滴在銅網(wǎng)上1～2次，用濾紙吸去剩余水，干燥放置，透射電鏡觀察。

1.2.6 納米銀對ADV3核酸的作用：將病毒滴度>107的首次擴增的腺病毒保存液，稀釋后接種于已長成單層的HeLa 細胞中，37℃吸附2 h，加入維持液放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞病變后于-20℃/37℃ 凍融3次收集病毒液。將等體積ddH2O，溶劑，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL納米銀分別與等體積病毒液混合。于室溫作用2 h后，參照Takara miniBEST RNA/DNA extr action試劑盒提取腺病毒DNA，針對Hexon區(qū)域進行擴增，Ad3F:GGTAGAGA TGCTG TTGCA GGA,Ad3R:CCCATCCATTAGTGTCATCG GT[3]。以94℃變性1 min，58℃退火50 s ，72℃延伸2 min，循環(huán)15次，以使其達到PCR的線性期，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 病毒毒力測定

采用Reed-Munch 法計算ADV3在HeLa細胞中的TCID50為10-2.74/100 μL，實驗中病毒攻擊量為100TCID50/100 μL。

2.2 納米銀對HeLa細胞的毒性作用

納米銀對HeLa細胞的毒性表現(xiàn)為細胞顆粒較多、增殖緩慢、折光性強。納米銀對細胞的毒性作用隨著藥物濃度的降低而降低。MTT結(jié)果表明，納米銀對Hela細胞的最大無毒濃度(TC0) 為52.48 μg/mL。

2.3 不同給藥方式下納米銀對ADV3的抑制作用

實驗結(jié)果表明，先ADV3后納米銀組、先納米銀后ADV3組、ADV3與納米銀同時作用組細胞存活率分別與ADV3病毒對照組細胞存活率相比，差異具有顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1 納米銀對ADV3的抑制作用

2.4 免疫熒光法檢測納米銀對ADV3的抑制作用

待Hela細胞在置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上長滿單層，將納米銀和腺病毒作不同處理后封片，于熒光顯微鏡下觀察：先ADV3后納米銀組、先納米銀后ADV3組、ADV3和納米銀同時作用組的細胞特異性熒光很少見，細胞病變較輕，有一定回縮，但間隙不大，形態(tài)基本正常；溶劑混合ADV3組和ADV3對照組中，Hela細胞的胞漿和胞核中均出現(xiàn)了很強的特異性綠色熒光，出現(xiàn)明顯細胞病變，細胞回縮變圓，間隙增大，相互融合成典型的葡萄串狀；正常Hela細胞中未見特異性綠色熒光，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。見圖1。

圖1 免疫熒光法檢測納米銀對ADV3的抑制作用

A.先ADV3后納米銀；B.先納米銀后ADV3；C.ADV3和納米銀同時作用；D.溶劑混合ADV3；E.ADV3；F.正常Hela細胞

2.5 納米銀對ADV3病毒粒子的破壞作用

將納米銀和ADV3病毒液作用不同時間(30、60、90、120、150 min)后進行磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察，結(jié)果如圖2所示。正常腺病毒顆粒直徑約為70～90 nm左右，電鏡觀察呈規(guī)則六邊形。腺病毒和納米銀作用30 min后，衣殼完整，但形態(tài)略有改變；在腺病毒和納米銀作用60 min后，納米銀已積聚病毒周圍，腺病毒衣殼雖完整，但已喪失規(guī)則形態(tài)；在腺病毒和納米銀作用90 min后，腺病毒衣殼已破壞，病毒形態(tài)不完整；在兩者作用120 min后，病毒衣殼已完全破壞；在兩者作用150 min后，腺病毒整個病毒粒子已破壞。

2.6 納米銀對ADV3核酸的作用

將等體積ddH2O，溶劑，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、納米銀與等體積病毒液混合，2 h后進行DNA提取，按Hexon進行擴增后，1%瓊脂糖電泳。實驗結(jié)果表明，與病毒對照組和溶劑組相比，納米銀作用后的各實驗組所擴增的目的條帶，其亮度均較低，見圖3。

3 討 論

腺病毒可通過呼吸道分泌物，糞-口途徑和污物在人與人之間傳播，許多嬰兒出生后5年內(nèi)至少感染過1種腺病毒株，且這種感染常發(fā)生在人群居住較密集的地方。腺病毒感染可發(fā)生在全年的任何時間，但疫情的爆發(fā)通常都集中在冬季、春季和初夏[4]。腺病毒在低pH值環(huán)境下可穩(wěn)定存在，有很強的耐物理和化學(xué)試劑的作用，腺病毒可對胃腸分泌物和膽汁產(chǎn)生耐受，在胃腸內(nèi)復(fù)制，可產(chǎn)生很高的病毒載量。腺病毒衣殼主要由五鄰體，六鄰體，纖突構(gòu)成，它們在病毒的感染復(fù)制中都起著關(guān)鍵作用。腺病毒感染細胞的過程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)與宿主細胞上的科薩奇腺病毒受體(Coxsackie -adenovirus receptor,CAR)結(jié)合，病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，通過內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細胞中并進入溶酶體[5]。在溶酶體的酸性環(huán)境下，腺病毒衣殼的構(gòu)象將發(fā)生變化，而從溶酶體中釋放出來，躲過溶酶體的消化作用。最后，腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細胞核，通過核孔將病毒DNA釋放到細胞核內(nèi)。

圖2 透射電鏡觀察納米銀在不同時間下對ADV3的破壞(200000×)

圖3 不同濃度納米銀與ADV3作用后PCR結(jié)果

病毒感染細胞并在細胞中進行復(fù)制和繁殖的全過程包括：病毒對細胞的吸附和侵入、脫殼、病毒遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、子代病毒顆粒的組裝、出芽和釋放。病毒在繁殖的每個環(huán)節(jié)都可能成為抗病毒藥物作用的靶點，通過干擾其中的一個或多個環(huán)節(jié)來抑制病毒的復(fù)制和繁殖。銀具有殺菌作用，在牙科、泌尿科、燒傷科應(yīng)用較多。納米銀在生物醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛[6]。與銀化合物相比，納米銀有明顯的物理化學(xué)和生物學(xué)特性，能更好的作用于感染的組織和細胞表面，納米銀在較低濃度可對細菌和真菌產(chǎn)生抑制作用。有關(guān)納米銀抗病毒的文獻已有報道，納米銀通過化學(xué)鍵很容易與外來原子相結(jié)合，使其吸附病毒的能力大大提高。這種結(jié)構(gòu)給各種反應(yīng)提供了作用和接觸吸附位點，與病毒之間相互產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)能力也快速增強。納米銀在體外可通過作用于gp120糖蛋白亞單位二硫鍵區(qū)域來抑制HIV和CD4+T結(jié)合，且<10 nm的納米銀與gp120的結(jié)合呈分子大小依賴性[7]；納米銀還可以和HBV的雙鏈DNA、胞外病毒粒子結(jié)合，且在體外能抑制HBV RNA 和胞外病毒粒子的產(chǎn)生[8]；納米銀亦能影響猴痘病毒的感染和空斑的形成[9]；經(jīng)由磺化巰基乙烷包被的納米銀可競爭性的與宿主細胞表面的硫酸乙酰肝素結(jié)合，從而阻斷HSV-1進入宿主細胞內(nèi)引發(fā)一系列感染[10]；納米銀亦可在體外通過抑制沙粒病毒早期的復(fù)制及RNA的產(chǎn)生和病毒粒子的釋放來控制其感染[11]。

本實驗探討了納米銀對腺病毒的抑制作用及其機制，MTT的實驗結(jié)果顯示，在最大無毒范圍內(nèi)，在三種不同給藥方式下，實驗組(先ADV3后納米銀、先納米銀后ADV3、納米銀和ADV3體外作用2 h后感染Hela細胞)與ADV3對照組相比，差異具有顯著性意義(P<0.01)，說明納米銀在體外不僅對腺病毒的復(fù)制增殖具有抑制作用，且能阻斷腺病毒對細胞的感染，還可直接滅活腺病毒。其可能機制為：納米銀進入細胞內(nèi)，對胞內(nèi)基因的代謝和表達起調(diào)節(jié)作用，從而抑制病毒核酸復(fù)制或阻止病毒蛋白合成；納米銀通過與細胞表面受體結(jié)合，改變細胞構(gòu)象，使對腺病毒敏感的細胞變?yōu)榉敲舾屑毎?，從而改變細胞膜上病毒的?shù)量和結(jié)構(gòu)來控制病毒的感染；納米銀與ADV3表面特定部位結(jié)合，在腺病毒吸附細胞的過程中破壞病毒的衣殼蛋白，阻止病毒的吸附，使病毒不能進入細胞內(nèi)復(fù)制。熒光實驗結(jié)果顯示，與ADV3組形成的特異性熒光相比，ADV3感染后再加入納米銀，抑制作用明顯(圖1A)，機制可能與納米銀進入到ADV3感染的Hela細胞內(nèi)并與病毒結(jié)合，從而抑制了ADV3的復(fù)制及相關(guān)蛋白的表達；細胞經(jīng)先納米銀后ADV3處理及納米銀和ADV3直接作用2 h后感染細胞，幾乎無熒光(圖1B、1C)，提示納米銀可與ADV3表面的纖突、細胞表面的CAR以及第二受體整合素等病毒感染相關(guān)蛋白結(jié)合，封閉其作用位點，阻斷ADV3侵入Hela細胞。透射電鏡結(jié)果顯示，與純病毒形態(tài)相比，在腺病毒和納米銀作用60 min后，納米銀已積聚病毒周圍，腺病毒衣殼完整，但已喪失規(guī)則形態(tài)(圖2C)；在腺病毒和納米銀作用90 min后，腺病毒衣殼雖已破壞，病毒形態(tài)不完整(圖2D)；相互作用120 min、150 min后，病毒粒子已完全破壞，病毒喪失完整形態(tài)(圖2E，2F)；說明納米銀對腺病毒體有直接破壞作用，進而可能會影響某些相關(guān)蛋白的表達和DNA的復(fù)制。PCR結(jié)果顯示，不同濃度納米銀與病毒液混合室溫作用2 h，提取DNA按設(shè)計的hexon引物進行擴增，與等體積水和溶劑作用組相比，納米銀作用后目的條帶亮度有所降低，且隨著納米銀濃度增大，擴增的目的條帶亮度亦減低。實驗結(jié)果提示，納米銀對ADV3 的DNA有一定破壞作用。

本研究的實驗結(jié)果表明，納米銀在體外對腺病毒具有抑制作用，其機制可能與直接破壞病毒粒子和DNA核酸，病毒衣殼蛋白如五鄰體、六鄰體蛋白等有關(guān)，亦或直接抑制病毒多聚酶的作用或增加新合成DNA的基因突變等影響病毒復(fù)制，從而影響其吸附、胞吞、溶解、釋放及核傳遞等一系列過程。進一步實驗如應(yīng)用Real Time-PCR技術(shù)來定量腺病毒DNA，Westernblot技術(shù)來確定納米銀與腺病毒作用后蛋白的破壞與減少程度，或使用探針技術(shù)來識別腺病毒及其與納米銀作用后分子標(biāo)記的變化等，值得深入研究。

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