付景麗,董炳梅,王 若,王家鑫

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室,河北保定071000)

布魯菌最主要毒力特征是在吞噬細(xì)胞內(nèi)生存和復(fù)制,這是布魯菌逃避宿主免疫監(jiān)視的主要原因[1]。目前,對(duì)布魯菌病的防控主要是接種疫苗,宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以細(xì)胞免疫為主,體液免疫為輔。然而,目前使用的疫苗大都為布魯菌減毒活疫苗[2],在實(shí)際應(yīng)用中活疫苗存在殘余毒力強(qiáng)、偶爾回復(fù)毒力等危險(xiǎn)。為避免傳統(tǒng)減毒疫苗的缺陷,根據(jù)布魯菌特殊的致病機(jī)制與機(jī)體對(duì)布魯菌的免疫應(yīng)答機(jī)制,我們尋找了布魯桿菌特異性外膜蛋白,并對(duì)其免疫效果做了相關(guān)研究。為研制安全、有效、新型靶化布魯菌外膜蛋白(OMPs)疫苗提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c小鼠(體重20～25 g,雄性,合格證編號(hào)904173)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,佐劑:Montanide IMS 251C VG由法國(guó)賽比克公司惠贈(zèng),Pro.Pure proteomics Grade 12.5%購(gòu)自Amresco,α-D-甘露吡喃異硫氰酸苯酯、TritonX-100、DMSO、4-甲基嗎啉購(gòu)自Sigma公司,2,6,10,14-四甲基十五烷購(gòu)自 Acros,Lysozyme Chicken Egg White、兩性洗滌劑3-14購(gòu)自Calbiochem,RPMI-1640購(gòu)自Invitrogen Corporation,Mouse IFN-γQuantikine ELISA Kit購(gòu)自R&D公司。

1.2 布魯菌OMPs的分離與純化

1.2.1 布魯菌OMPs的提取 將布魯菌豬種S2型約3×105億活菌,用 PBS緩沖液 5 000 r/mim×20 min離心,洗滌3次,棄上清。之后按照文獻(xiàn)[3]方法步驟操作,18 000 r/min4℃離心20 min,取上清,4℃保存。

1.2.2 布魯菌的電洗脫OMPs純化 (1)蛋白的濃縮與兩性洗滌劑的去除:取上提取蛋白,以體積比1∶4加入丙酮,15 000 r/min離心20 min,收集沉淀,加入10 mmol/L Tris Buffer溶解,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量,調(diào)整蛋白濃度為1 mg/mL。(2)使用Pro.Pure proteomics Grade 12.5%進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(3)SDS-PAGE電泳后,取出凝膠直接置于100 mmol/L的 KCl溶液中,4℃浸泡2 h;參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白從凝膠上切下目的條帶,裝入透析袋中,加入適量pH值7.2 PBS,恒壓80 V電泳45 min;收集電洗脫液,即純化的目的蛋白。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在波長(zhǎng)260 nm和280 nm時(shí)的光吸收值,按蛋白濃度(mg/mL)=(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù),計(jì)算樣品中蛋白含量,分裝,用冷凍干燥機(jī)將所得目的蛋白凍干,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 布魯菌OMPs的糖基化修飾與糖基化產(chǎn)物的鑒定

1.3.1 OMPs的糖基化修飾 把2 mg蛋白質(zhì)加入200 μ L二甲基亞砜(DMSO)中混勻,然后加入4 mg α-D-甘露吡喃異硫氰酸苯酯和2 μ L 4-甲基嗎啉,混合物150 r/min搖動(dòng)過夜,再加入 100 μ L 1 mol/L T ris-HCl(pH值7.5)作用1 h,以水解甘露糖。之后,-20℃保存。

1.3.2 間苯二酚-硫酸法鑒定擬糖蛋白 將20 μ L梯度稀釋的α-D-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μ g/mL)和修飾的蛋白、未修飾的蛋白分別加入200 μ L離心管中,再加入間苯二酚(6 mg/mL)20 μ L 、75%硫酸100 μ L 和姥蛟烷 50 μ L,混勻,置于 90 ℃水浴反應(yīng)30 min,取出后暗盒靜置30 min。從反應(yīng)管中取90 μ L移入96孔板中,檢測(cè)OD405nm吸光值[4]。

1.4 蛋白抗原與佐劑乳化成試驗(yàn)用疫苗。

1.5 免疫接種試驗(yàn) 采取完全隨機(jī)資料的方差分析比較如下種類的免疫效果:60只6～8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組:A組、B組、C組、D組、E組,每組12只,分別接種:純化蛋白質(zhì)、糖基化蛋白質(zhì)、試驗(yàn)用疫苗、布魯菌病活疫苗(S2)、PBS;接種途徑:皮下注射;接種劑量:s2疫苗組3億CFU/只 ,其他組均為 15 μ g/只;免疫次數(shù):兩次 ;免疫間隔為兩周。

1.5.1 試驗(yàn)取材 (1)一免后 4、7、10、14 d,二免后 4、7、10 、14 d,尾靜脈 、隱靜脈采血 ,分離血清 ,進(jìn)行抗體 IgG檢測(cè)。(2)一免后4、10 d;二免后4、10 d,進(jìn)行眼眶靜脈叢取血,置1.5 mL Eppendorf管中,室溫靜置30 min,5 000 r/min離心10 min,取上清,置-20℃低溫冰箱中保存待測(cè) γ-干擾素(IFN-γ)濃度。

1.5.2 試驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)的檢測(cè) 血清中抗體采取ELISA法檢測(cè),結(jié)果讀取450 nm處OD值;血清中IFN-γ采用Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit檢測(cè),結(jié)果以pg/mL表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌OMPs的分離與純化后SDS PAGE電泳結(jié)果 見圖1。

圖1 布魯菌全外膜蛋白(左),目的外膜蛋白(右)

2.2 糖基化產(chǎn)物的鑒定結(jié)果 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)甘露糖溶液的OD405值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算糖基化產(chǎn)物的含糖量為:0.301 mg/mL,未糖基化蛋白:0.045 mg/mL,糖基化蛋白的含糖量顯著高于未糖基化蛋白,證明蛋白質(zhì)已經(jīng)成功被糖基化。

2.3 免疫接種試驗(yàn)結(jié)果 見圖2、圖3。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)利用布魯菌蛋白或核酸組分免疫動(dòng)物 ,可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[5]。組分苗具有無菌體毒力增強(qiáng)現(xiàn)象和致敏原性弱等優(yōu)點(diǎn)。OMPs位于細(xì)菌的表面,容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別,在與宿主的相互作用中發(fā)揮作用。另一方面,很多外膜蛋白都具有免疫原性,其中很大一部分是免疫保護(hù)抗原[6-7]。本試驗(yàn)選擇了分子質(zhì)量分別為37.5 kD與47.2 kD的布魯菌OMPs進(jìn)行了抗原性分析研究。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是惟一能激活初始性T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞。DC表面有豐富的甘露糖受體(mannose receptor,MR),MR可快速循環(huán)于胞膜和早期內(nèi)體間,在較短的時(shí)間內(nèi)即可內(nèi)化大量的抗原[8]?；贛R可有效介導(dǎo)抗原的攝取及內(nèi)化,我們將布魯菌OMPs抗原進(jìn)行了甘露糖修飾,使其含有DC表面MR的特異性配體,進(jìn)行更有效的T細(xì)胞應(yīng)答。結(jié)果說明,本試驗(yàn)篩選的布魯菌OMPs具有良好的免疫原性,經(jīng)α-D-甘露吡喃異硫氰酸苯酯糖基化修飾后有效提高了DC的吞噬與抗原提呈作用,增強(qiáng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

納米佐劑均勻性好,包裹或吸附抗原顆粒后成為巨噬細(xì)胞和DC的首選吞噬目標(biāo) ,而且納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后 ,可以避免常規(guī)佐劑的載體效應(yīng) ,保護(hù)抗原[9]。為此本試驗(yàn)侯選蛋白抗原經(jīng)糖基化修飾后,與新型納米顆粒佐劑乳化成試驗(yàn)用疫苗。BALB/c小鼠免疫接種試驗(yàn)結(jié)果顯示,試驗(yàn)用疫苗與其他組相比,血清中IFN-γ水平呈逐漸升高趨勢(shì),特別是在二免后出現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05)。說明試驗(yàn)用疫苗有效誘導(dǎo)了機(jī)體的免疫應(yīng)答,且產(chǎn)生了免疫記憶;血清中IgG抗體水平各處理組均高于PBS對(duì)照組,試驗(yàn)用疫苗略好于其他處理組。

本試驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室,對(duì)動(dòng)物用布魯菌靶向化疫苗進(jìn)行了大膽的設(shè)計(jì)與研究,取得了理想的試驗(yàn)結(jié)果。

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