鄧海平,蒲萬霞 ,梁劍平,倪春霞,孟曉琴

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所中國農業(yè)科學院新獸藥工程重點開放實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州730050)

奶牛乳房炎是一種主要由病原微生物引起的奶牛常見病,是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)生產經(jīng)濟損失的重要因素之一,不僅影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)、乳品工業(yè)的發(fā)展。金黃色葡萄球菌感染是引起奶牛乳房炎最主要的原因之一,乳房炎奶樣中其檢出率均在30%以上[1-2]。及時準確的掌握病原菌的種類和分子流行病學趨勢對于該病的臨床治療和疫苗的研制都非常重要。隨著分子生物學的發(fā)展,越來越多的分子生物學方法被應用于病原菌的鑒定和分子流行病學研究,16S rRNA保守序列就是常用于細菌鑒定分子標記之一。DNA隨機多態(tài)性擴增(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技術是一種簡便、靈敏可行的新的遺傳標記技術。該技術問世后迅速在國內外被廣泛應用于微生物的基因分型與鑒定[3-4]。近年來有關金黃色葡萄球菌基因分型的研究主要集中于人醫(yī)來源的菌株,畜源菌株的基因分型研究相對較少。本試驗利用16S rRNA保守序列對引起內蒙古地區(qū)奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌進行鑒定及RAPD基因分型研究,探討該地區(qū)金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎分子流行病學特點,為我國奶牛乳房炎基因工程疫苗的研制提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 DNA Ladder Marker(分子量依次為4 500 bp,3 000 bp,2 250 bp,1 000 bp,750 bp,500 bp,250 bp)、DL 2 000 Marker、Premix Ex Taq酶等購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA提取試劑盒購自Tiangen生物制品公司;金黃色葡萄球菌標準菌CVCC2246購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;基因擴增儀(Biometra,UK),DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 金黃色葡萄球菌分離鑒定

1.2.1 細菌純化培養(yǎng) 100份臨床型乳房炎患牛奶樣分別來自內蒙古地區(qū)3個奶牛場。奶樣接種于綿羊血平板培養(yǎng)基和卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基做純化培養(yǎng)。

1.2.2 金黃色葡萄球菌生化鑒定 將菌落形態(tài)、鏡檢結果符合葡萄球菌特征的菌株參考相關生化特性進行金黃色葡萄球菌生化鑒定。

1.2.3 金黃色葡萄球菌分子生物學鑒定 根據(jù)已發(fā)表的金黃色葡萄球菌的16S rRNA基因保守序列(GenBank登錄號 X68417),設計合成引物:P1:5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′,P2:5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′。提取菌落形態(tài)、鏡檢結果符合葡萄球菌特征菌株基因組DNA作為模板進行PCR擴增,擴增產物-20℃凍存。

1.3 金黃色葡萄球菌分離株RAPD基因分型 選擇序列 OLP13:5′-ACCGCCTGCT-3′,作為擴增引物。采用25μ L反應體系,PCR循環(huán)參數(shù)分別為:94℃5 min,37℃5 min,72℃5 min,循環(huán)4次;94℃1 min,37℃1 min,72℃2 min,循環(huán) 30次;72℃延伸10 min。擴增產物-20℃凍存。

1.4 擴增產物凝膠電泳分析 取分子鑒定及RAPD擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳,電泳結果用凝膠成像系統(tǒng)紫外成像。

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用BioNumerics軟件對RAPD擴增電泳結果進行數(shù)據(jù)處理,圖像采用Dice相關系數(shù)和非加權組算術平均法來進行聚類分析。

2 結果

2.1 菌株分離鑒定結果 菌株經(jīng)生化鑒定,符合金黃色葡萄球菌生化指標菌株為35株。經(jīng)16S rRNA基因PCR擴增后,有35株菌產生了450 bp左右的目的片段(圖1)。表明生化鑒定結果與分子鑒定結果完全一致。對鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株進行編號N01～N35。菌株在3個牛場的分布情況如表1。

圖1 金黃色葡萄球菌16S rRNA鑒定結果

表1 金黃色葡萄球菌分離鑒定結果

2.2 RAPD擴增結果 對35株金黃色葡萄球菌基因組DNA模板進行RAPD擴增。結果顯示,所有菌株基因組DNA經(jīng)擴增后均產生了清晰、可分辨的帶譜,擴增產物在1～8條帶之間,具有多種帶型組成(圖2)。

2.3 RAPD產物的遺傳相關性分析 利用Bio-Numerics分析軟件對35株金黃色葡萄球菌染色體DNA的RAPD產物電泳圖譜進行聚類分析,建立了親緣關系聚類圖(圖2)。由圖2可以看出,以相似性40%為標準(虛線所示),35株臨床獲得的金黃色葡萄球菌根據(jù)其遺傳差異分為6個聚類群。其中Ⅰ型2株(占 5.7%),Ⅱ型 3株(占 8.6%),Ⅲ型6株(占17.1%),Ⅳ型 15株(占 42.9%);Ⅴ型 5株(占14.3%)、Ⅵ型5株(占14.3%)。

3 討論

3.1 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌分離鑒定 金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要傳染性病原菌之一,由其引起的炎癥具有傳染性強和難治愈的特點[5]?？焖贉蚀_的掌握引起奶牛乳房炎病原菌的種類和分布是防治奶牛乳房炎和疫苗研制的首要條件[6]。隨著分子生物學技術的發(fā)展,通過細菌保守序列PCR擴增來確定其種類的方法被越來越多的應用于病原微生物的分離鑒定。本試驗利用了金黃色葡萄球菌16S rRNA高度保守序列設計了對應引物對奶樣中分離出的金黃色葡萄球菌進行了分子鑒定,并與傳統(tǒng)方法鑒定結果進行了比較。結果表明,兩種方法的鑒定結果完全吻合。但是分子鑒定的方法只需1～2 d即可得出結果且具有較高的特異性,縮短了細菌性奶牛乳房炎的診斷時間,為及時的臨床治療提供了保障。

3.2 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌RAPD基因分型

RAPD是近年來興起的一種新的揭示基因多態(tài)性的基因分型方法,其特點是不需預先知道有關基因序列,只需采用通用的隨機引物對基因組DNA進行擴增,利用擴增產物指紋圖譜進行基因分型。據(jù)國外研究報道,利用RAPD方法對醫(yī)院分離的金黃色葡萄球菌進行分型并與PFGE方法分型結果進行比較后發(fā)現(xiàn)兩種方法分辨力相當且分辨結果高度一致[7-8]。說明RAPD與PFGE在金黃色葡萄球菌分型方面具有相同的高效性。

本試驗對采自內蒙古地區(qū)乳房炎奶樣中的35株金黃色葡萄球菌進行了RAPD分型。從 RAPD產物指紋圖上可以看出,所有菌株染色體DNA擴增后均得到了清晰可分辨的條帶,具有多種帶型組成,清楚地反應了菌株間的基因多態(tài)性特征。聚類分析樹狀圖結果將35株菌分為了6個基因型,其中Ⅳ型菌株占了總數(shù)的40%以上,為該地區(qū)主要流行的優(yōu)勢菌群。15株Ⅳ型菌中有13株相似性在85%以上且均含有大小約2 000 bp的一條片段,推測這些菌株可能是來自于同一親本不同克隆的菌株。根據(jù)不同基因型菌株在3個牛場的分布可以看出,除了牛場C外,其他兩個牛場中的金黃色葡萄球菌均有各自明顯的流行優(yōu)勢菌群。說明菌株在各牛場之間有廣泛流行傳播,但是地區(qū)間菌株基因型還是有一定的特異性。牛場C中菌株分為4個基因型且分布較平均,這可能與該牛場衛(wèi)生環(huán)境較差,奶牛乳房炎發(fā)病率高,病原菌流行廣泛有關。

應用RAPD技術對畜源病原菌進行快速流行病學調查,為獸醫(yī)傳染病分子流行病學研究提供了可行的研究方法,其在獸醫(yī)分子流行病學和傳染病學等領域具有較廣闊的應用前景。

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