林居純,曹三杰,蔣紅霞,曾振靈

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室,廣東廣州510642;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川 雅安 625014)

細菌性感染一直危害著畜禽健康,對病原菌做出快速準確診斷是控制疾病發(fā)展前提。細菌常規(guī)鑒定所需時間長,尤其對生長緩慢或難以培養(yǎng)病原菌要做出及時正確診斷顯得更加困難。隨著分子生物學(xué)發(fā)展,PCR技術(shù)已被用于臨床檢測病原菌,但常規(guī)PCR需設(shè)計針對病原菌的特異引物,對分離未知細菌或混合感染,則難以實現(xiàn)快速診斷目的[1-2]。

本試驗利用細菌種系發(fā)育過程中具有重要意義的16S rDNA基因為檢測靶點,構(gòu)建了細菌16S rDNA基因芯片,并對獸醫(yī)臨床重要病原菌進行了檢測,為實現(xiàn)基因芯片技術(shù)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床提供初步研究。

1 材料與方法

1.1 標準菌株 大腸桿菌ATCC25922(Escheria coli)、沙門菌 C79-13(Salmonella pullorum)、金黃色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcus aureus)、無乳鏈球菌CVCC1887(Streptococcus agalactiae)、雞毒支原體 PG31(Mycoplasma gallisepticum)由本實驗室保存提供。

1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-tek公司;PCR相關(guān)試劑及pMD18-T載體購自TaKaRa公司;氨基基片、雜交緩沖液等購自上海百傲科技有限公司;Cy3-dCTP購自Amersham Biosciences;Lambda定位基因由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)基因芯片實驗室提供;SpotArrayTM24芯片點樣儀、ScanArray·4000掃描儀購自Packard Bioscience公司;PX2梯度PCR儀購自Thermohybaid公司;2000型凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)、Smart SpaceTM3010核酸蛋白檢測儀購自Bio-RAD公司。

1.3 引物設(shè)計 參考E.coli等5種微生物16S rDNA序列,設(shè)計擴增16S rDNA V1-V3區(qū)490 bp片段的通用引物。引物序列16S1:5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′,16S2:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

1.4 靶基因克隆、鑒定及制備 將 E.coli ATCC25922等5種標準菌株,采用水煮沸法提取DNA用作PCR模板。PCR體系:dNTP(各 2.5 mmol/L)5.0 μ L,Ex Taq(5 U/μ L)0.25 μ L,10 ×ExTaq Buffer 5.0 μ L,引物 16S1 和 16S2(10 μ mol/L)各 1.0 μ L,模板 2.0 μ L,加 ddH2O 至 50 μ L 。 反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸25 s,共30個循環(huán),72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物回收克隆到pMD18-T后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,送TaKaRa公司測序。

提取重組質(zhì)粒DNA為PCR模板,按上述PCR擴增條件擴增靶基因。靶基因PCR產(chǎn)物純化后,用紫外核酸蛋白儀測定其濃度及純度。

1.5 16S rDNA基因芯片制備 將純化后靶基因PCR產(chǎn)物和定位基因稀釋至200 mg/L,用SpotArrayTM24接觸式芯片點樣系統(tǒng)在氨基化基片上點樣。點樣陣列為1～6行分別為E.coli、Salmonella、S.aureus、S.agalactiae、M.gallisepticum 和Locted gene,每行 12點,各樣點中心間距為 650 μ m,樣點直徑為220 μ m。將點制好芯片靜置于點樣儀上過夜干燥,經(jīng)水合,紫外交聯(lián),洗滌及離心干燥后密封,室溫保存。

1.6 探針制備 采用Cy3-dCTP隨機滲入標記法制備探針。標記體系內(nèi)含 dA+T+GTPmixture(各 10 mmol/L)3 μ L,dCTP(10 mmol/L)0.5 μ L,Cy3-dCTP(0.25 mmol/L)0.5 μ L,Ex Taq(5 U/μ L)0.5 μ L,10 ×Ex Taq Buffer(Mg+Plus)5.0 μ L,引物 16S1 和 16S2 各 1.0 μ L,模板 DNA 2.0 μ L,加 ddH2O 至 50 μ L。PCR參數(shù)同1.4。

1.7 芯片雜交及數(shù)據(jù)分析 基因芯片于95℃水浴變性3 min后轉(zhuǎn)置95%冰冷乙醇中冷卻,1 000 r/min離心干燥5 min。在芯片點樣區(qū)加25 μ L預(yù)雜交液42℃預(yù)雜交1 h,將變性探針及標記定位基因混合液20 μ L加于芯片點樣區(qū),47℃雜交3 h。雜交結(jié)束后,分別以1、2號和3號洗液洗滌芯片 3～5 min,三蒸水漂洗 3 min,離心干燥后基因芯片掃描儀掃描。陽性信號判斷采用樣點信號總強度值≥1.5倍背景強度值,即SNR≥1.5,同時結(jié)合信號強度中位值(intensity)＞1 000或掃描圖像上雜交斑點明顯可見為判斷標準[3]。

1.8 基因芯片特異性及靈敏度試驗 將5種標準菌制備的探針及定位基因標記物,分別與芯片雜交,以檢測芯片特異性。將S.aureus ATCC25923制備的探針稀釋成系列濃度:1,3,30,300,3 000,9 000,27 000 μ g/L,分別與芯片雜交,經(jīng)熒光掃描儀掃讀信號,以檢測基因芯片雜交系統(tǒng)靈敏度。

1.9 臨床樣品檢測 102份臨床樣品經(jīng)培養(yǎng)后,對疑似菌株分別進行基因芯片檢測、常規(guī)生化鑒定及血清學(xué)鑒定,以比較芯片檢測與常規(guī)細菌學(xué)檢測結(jié)果的一致性。經(jīng)常規(guī)細菌學(xué)鑒定的菌株,按2種、3種及4種方式將不同種類菌制成混合樣品,與芯片雜交,以判斷芯片對多個樣品同時檢測的可行性。

2 結(jié)果

2.1 靶基因的擴增和序列分析 通用引物擴增E.coli等5種不同微生物,均獲得約490 bp片段。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示,擴增片段為細菌16S rDNA V1-V3 區(qū)片段 ,E.coli、S.pullorum 、S.aureus、S.agalactiae和M.gallisepticum與GenBank序列同源性分別為98.8%、98.8%、99.8%、98.6%和98.2%。

2.2 基因芯片特異性試驗及靈敏度試驗 5種探針和定位基因標記物,在相同雜交條件下分別與基因芯片雜交結(jié)果顯示,除大腸桿菌和沙門菌探針與基因芯片雜交有交叉雜交外,其他探針與芯片雜交特異性高(見中插彩版圖1)。靈敏度試驗表明,當靶基因濃度為 200 mg/L時,探針濃度為 3 μ g/L時,其雜交信號Media intensity為2056,SNR值為1.654,而探針濃度為 1 μ g/L時,信號總強度值低于背景總信號強度值,這表明所構(gòu)建芯片系統(tǒng)靈敏度為 3 μ g/L 。

2.3 臨床樣品檢測結(jié)果 不同鑒定方法對102份臨床樣品的檢測結(jié)果見表1。從表1可見基因芯片對S.aureus、Streptococcus和 M.gallisepticum 鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)生化試驗和血清試驗結(jié)果一致,但對于大腸桿菌和沙門菌不能鑒定?；蛐酒瑢τ赟.aureus、Streptococcus和M.gallisepticum2種或 3種菌混合樣能同時檢測,但對大腸桿菌或沙門菌混合樣不能正確檢測。

表1 不同方法檢測102份臨床樣品結(jié)果

3 討論與結(jié)語

實現(xiàn)細菌通用檢測,一直是臨床診斷所需解決的熱點問題,尋找適合靶分子又是實現(xiàn)細菌通用檢測的關(guān)鍵。16S rDNA基因常以多拷貝形式存在于原核生物中,分為可變區(qū)和恒定區(qū),其中可變區(qū)包含種間差異信息使其具有特異性,恒定區(qū)決定了檢測的穩(wěn)定性,多拷貝存在形式使檢測具有敏感性,故常選用16S rDNA作為原核生物檢測靶點[4]。本試驗比對了獸醫(yī)臨床常見5種微生物16S rDNA序列,在恒定區(qū)設(shè)計通用引物,擴增大腸桿菌等16S rDNA V1-V3可變區(qū),PCR產(chǎn)量高特異性強,且制備了16S rDNA PCR產(chǎn)物基因芯片,用于檢測獸醫(yī)臨床常見5種病原菌。

基因芯片特異性試驗及對臨床分離樣品檢測顯示,本次制備的16S rDNA芯片能鑒定S.aures、Streptococcus、M.gallisepticum 3 種微生物,特異性高;對102份臨床樣本中的1株S.aures,3株Streptococcus,3株M.gallisepticum進行了正確鑒定,與生化和血清學(xué)鑒定結(jié)果符合率達100%;對于混合樣,能檢測其中的 S.aures、Streptococcus、M.gallisepticum 3種菌株,對E.coli和Salmonella樣本基因芯片雜交結(jié)果不理想,存在交叉雜交,原因是E.coli和Salmonella的16S rDNA同源性高達90%以上,在系統(tǒng)進化樹上同屬很小的分枝,一般認為同源性大于80%的基因交叉雜交高達26%～57%,基因片段重疊和同源性高是引起交叉雜交的原因[5]。因此提示了16S rDNA PCR產(chǎn)物芯片,盡管省錢、省事,雜交后信號強,靈敏度高,但進行同一科、屬內(nèi)菌株的鑒定很難達到理想效果,所以對基因同源性非常高細菌進行鑒別,最好結(jié)合細菌相關(guān)毒理基因,設(shè)計特異性引物進行擴增和雜交,或使用寡核苷酸探針,按通用探針和針對細菌科、屬和種特異性探針聯(lián)合的方式,才有可能達到理想的鑒定效果[6-7]。

本次制備的16S rDNA基因芯片,成功地鑒定了獸醫(yī)臨床常見的 S.aures、Streptococcus、M.gallisepticum 3種病原菌,對于這3種菌株混合樣也能正確鑒定,基因芯片系統(tǒng)靈敏度達3 μ g/L,但對于同源性非常高的E.coli和Salmonella不能鑒定。下一步的研究工作將擴大探針的數(shù)目,特別是能區(qū)分同一科屬細菌的特異性探針,同時擴大病原菌檢測范圍,優(yōu)化雜交體系和條件,加快基因芯片技術(shù)的實用化研究進程。

[1]Berite E C,Maria P S,Jorg G,et al.Identification and characterization of bacterial pathogens causing bloodstream infection by DNA microarray[J].Journal of clinical microbiology,2006,44(7):2389-2397.

[2]羅雯,萬雅各,彭宣憲,等.采用通用引物 PCR配合 SSCP及RFLP技術(shù)快速檢測常見病原菌[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2001,21(6):687-689.

[3]曹三杰,黃小波,文心田,等.豬傳染性胃腸炎病毒檢測基因芯片的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2009,29(2):121-125.

[4]Jill E C.Impact of 16S rDNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infection diseases[J].Clinical Microbiology Reviews,2004,17(4):840-862.

[5]Evertsz M,Au-young J,Ruvolo M W,et al.Hy bridization cross-reactivity within homologous gene families on glass cDNA microarrays[J].Biotechniques,2001,31(5):1184-1186.

[6]翟俊輝,宋亞軍,杜宗敏,等.通用基因芯片檢測感染細菌方法的研究[J].中國公共衛(wèi)生,2003,19(4):430-431.

[7]毛正果,鄭浩軒,王新穎,等.基因芯片檢測常見腸道致病菌感染的研究與評價[J].胃腸病學(xué)與肝病學(xué)雜志,2008,17(10):809-812.