蘇建青，褚秀玲，江 成，馬秀亮，張吉清

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252059）

犬瘟熱是犬類(lèi)、毛皮動(dòng)物和部分海洋哺乳動(dòng)物的一種多發(fā)性、高度接觸性烈性傳染?。?］。病毒細(xì)胞受體是病毒宿主特異性和組織嗜性的一個(gè)決定因素，在病毒識(shí)別細(xì)胞受體進(jìn)而感染宿主過(guò)程中起重要作用［2］。Tatsuo H 等［3－4］證實(shí)了犬的信號(hào)淋巴細(xì)胞激活因子（signalling lymphocyte activation molecule，SLAM）是犬瘟熱病毒（Canine distemper rirus，CDV）的感染細(xì)胞受體。SLAM（也稱(chēng)為CD150，CDw150，PIO－3）是表達(dá)在未成熟的胸腺細(xì)胞、CD45RO＋記憶性T細(xì)胞，激活的T和B淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表面上的糖蛋白，對(duì)調(diào)控機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖、免疫球蛋白合成和分泌IFN－γ等細(xì)胞因子的共刺激因子等具有重要作用［5－6］。為了解比格犬犬瘟熱細(xì)胞受體SLAM的序列結(jié)構(gòu)特征以及相關(guān)物種間的差異，本研究擬對(duì)比格犬的細(xì)胞受體SLAM進(jìn)行克隆和序列分析，以掌握其序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和其他物種間的差別，了解其功能結(jié)構(gòu)區(qū)域和作用位點(diǎn)，為進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)犬SLAM受體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 犬淋巴細(xì)胞分離液（LTS－1079）為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所產(chǎn)品；RPMI－1640培養(yǎng)基、Trizol、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、dNTP、刀豆球蛋白 A（concanavalin A，ConA）、OligodT（15）、r Taq DNA 聚合酶、pMD 18－T載體、感受態(tài)細(xì)菌JM109以及各種限制性?xún)?nèi)切酶為泰安聯(lián)星生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 比格犬來(lái)自寵物醫(yī)院門(mén)診，雄性，2歲，體重16.5kg。

1.2 方法

1.2.1 犬外周血淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng) 用加有肝素抗凝劑的無(wú)菌注射器采集5mL比格犬的血液，按照犬淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞分離，將分離后的淋巴細(xì)胞用Hank′s液洗2次，用含100mL／L小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋s106個(gè)細(xì)胞／mL），加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如果細(xì)胞生長(zhǎng)良好，每孔加入濃度1mg／mL Con A（終濃度10μg／mL）繼續(xù)培養(yǎng)48h，收獲淋巴細(xì)胞，用PBS（pH 7.2）洗滌2次后，用于 mRNA的提取。

1.2.2 引物 參考GenBank發(fā)表的犬SLAM基因序列（accession number：AF390108）設(shè)計(jì)擴(kuò)增犬SLAM基因編碼區(qū)引物。上游引物5′－GCCGATGGATTCCAGGGGCT－3′ ；下 游 引 物 5′－TCAGC TCTCTGGGAACGTCA－3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增片段大小預(yù)期約1 033bp。

1.2.3 RNA的提取與cDNA的合成 RNA的抽提使用Trizol試劑按照說(shuō)明操作。以10g／L的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用分光光度法檢測(cè)RNA的含量和純度。參照Promega公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。反應(yīng)體系如下：將適量DEPC水溶解的RNA于70℃溫育10min后，依次加入25pmol／μL OligodT（15）引物 1μL，2.5mmol／L dNTP 4μL，AMV RT 5×buffer 4μL，RNase inhibitor 0.5μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5μL，最后加DEPC水至終體積20μL，42℃水浴1h，將樣品于95℃加熱5min，置－20℃保存。

1.2.4 SLAM 基因的擴(kuò)增 根據(jù)TaKaRa r Taq DNA聚合酶說(shuō)明書(shū)，建立20μL PCR擴(kuò)增體系。PCR條件如下：首先94℃變性5min；94℃1min，53℃70s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物按pMD18－T說(shuō)明書(shū)連接到PMD18－T克隆載體上，挑選陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 序列分析 使用DNASTAR軟件中的Clustal W將克隆測(cè)序得到的比格犬SLAM與人、牛、海豹、羊和狐貍等的SLAM基因序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam（http：／／expasy.org／tools／protparam.htmL）計(jì) 算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量；利用在線(xiàn)分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)程序 Tmpred（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html）檢測(cè)潛在跨膜區(qū)；利用信號(hào)肽在線(xiàn)預(yù)測(cè)工具SignalP（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預(yù)測(cè)信號(hào)肽區(qū)域；利用在線(xiàn)N－糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具NetNGlyc（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）預(yù)測(cè)跨膜區(qū)外的潛在N－糖基化位點(diǎn)［8］。

2 結(jié)果

2.1 比格犬SLAM基因的克隆

通過(guò)RT－PCR從比格犬外周血淋巴細(xì)胞中成功擴(kuò)增到SLAM基因序列（圖1），擴(kuò)增片段約1.0 kb以上，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段全長(zhǎng)1 033bp，其中開(kāi)放閱讀框（ORF）包括1 029個(gè)核苷酸，編碼342個(gè)氨基酸，和NCBI上公布的犬SLAM基因大小完全一致。

圖1 SLAM cDNA RT－PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 SLAM cDNA RT－PCR products electrophoresis result

2.2 同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

用Clustal W軟件對(duì)6個(gè)物種的SLAM進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸多序列比對(duì)，人、牛、羊、狐貍和海豹的GenBank序列號(hào)分別是Human（AY040554）， Cattle （AF329970）， Sheep（NM001040288），F(xiàn)ox （EU678638） 和 Seal（AB428368）。比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1，右上角是6個(gè)物種的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，左下角是6個(gè)物種的推導(dǎo)氨基酸比對(duì)結(jié)果，和比格犬SLAM基因相似度最高的是狐貍，其次是海豹，這也和臨床犬瘟熱病毒可以感染這3種動(dòng)物一致。牛和羊的相似度較高，符合臨床牛瘟病毒可以同時(shí)感染牛和羊。說(shuō)明了細(xì)胞受體決定了病毒感染宿主種類(lèi)的關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)各物種推導(dǎo)氨基酸的序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)目前已經(jīng)證實(shí)的幾個(gè)受體關(guān)鍵性氨基酸，如位點(diǎn)60、63、66、68、72、84、119、121和130具有較高的保守性，特別是犬、狐貍和海豹的完全相同。

基于多序列比對(duì)的結(jié)果，使用DNA Star軟件中的 Neibor－joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，比較不同物種SLAM基因的遺傳關(guān)系（圖2）。狗和狐貍的最近，其次是海豹，牛和羊在一個(gè)分支，人單獨(dú)形成一個(gè)分支。

2.3 理化性質(zhì)分析

ProtParam分析顯示，SLAM蛋白的理論分子質(zhì)量為38.16ku，等電點(diǎn)為8.02。潛在跨膜區(qū)進(jìn)行分析顯示，SLAM中239aa～263aa區(qū)間的得分高達(dá)3 036，屬于SLAM的跨膜區(qū)。信號(hào)肽進(jìn)行分析顯示，SLAM中1aa～26aa的平均得分高達(dá)0.838，可能的剪切位點(diǎn)在26aa和27aa之間。NetNGlyc預(yù)測(cè)SLAM膜外區(qū)的N－糖基化結(jié)果顯示，從N端第57、102、125、150、157位均存在可能性大于50%的N－糖基化位點(diǎn)，共5個(gè)。在SLAM的胞漿區(qū)序列中同樣也包含3段高度保守的富含酪氨酸的基序（TxYxxV／I／A），被認(rèn)為和SLAM的活化高度相關(guān)。以上分析顯示，SLAM符合Ⅰ型跨膜糖蛋白的特征，N端具有26aa的信號(hào)肽區(qū)域，中間具有24aa的跨膜區(qū)域，胞外區(qū)具有5個(gè)潛在的N－糖基化位點(diǎn)（NX－S／T），胞內(nèi)區(qū)具有3個(gè)保守的酪氨酸基序，和已經(jīng)報(bào)道的其他CD2家族成員的結(jié)構(gòu)相似。

表1 不同物種間SLAM核苷酸和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequence identifies of SLAM gene among different species

圖2 SLAM的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of SLAM gene sequences

3 討論

近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明CDV比以前設(shè)想的具有更廣的宿主范圍，如CDV可以感染海豹、獅子、老虎、恒河猴、大熊貓和豹子等［7］。細(xì)胞表面受體為病毒的組織嗜性和感染宿主范圍的決定因素，CDV的跨種間傳播現(xiàn)象與其感染宿主的細(xì)胞受體的表達(dá)有著密切關(guān)系。犬信號(hào)淋巴細(xì)胞激活因子被證明是犬瘟熱病毒感染宿主并引起免疫抑制的一個(gè)重要受體。SLAM是包含有胞質(zhì)內(nèi)尾部和特征信號(hào)序列的一類(lèi)雙功能受體，屬于免疫球蛋白CD2超家族成員之一。SLAM對(duì)調(diào)控機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖、免疫球蛋白合成和分泌IFN－γ等細(xì)胞因子的共刺激因子等具有重要作用。

因?yàn)榧?xì)胞SLAM作為大部分副黏病毒的受體，目前已經(jīng)確認(rèn)的有人的麻疹病毒、牛的牛瘟病毒、羊的小反芻獸疫病毒和鯨、海豹等動(dòng)物的瘟熱病毒等。為了進(jìn)一步研究犬瘟熱病毒的跨種族傳播和宿主范圍的擴(kuò)大，我們對(duì)常見(jiàn)的幾種副黏病毒感染人、牛、羊、狐貍和海豹的SLAM受體進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別高達(dá)73.6%～98.4%和63.0%～98.8%，為CDV 的跨種族傳播奠定了基礎(chǔ)。特別是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和報(bào)道［9－10］的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)高度保守一致，如位點(diǎn)60（Ile）和61（His）在5種動(dòng)物中都一致，位點(diǎn)63、66、68、72、84、119、121和130在犬、狐貍和海豹中都一致，在牛和羊中都一致，即使是不一致的氨基酸如位點(diǎn)63（中性），119（中性），121（羥基類(lèi)中性）和130（堿性）的氨基酸極性或類(lèi)型高度一致。SLAM屬于CD2家族的成員之一，其相類(lèi)似蛋白的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被測(cè)定，位于胞外的部分形成一個(gè)遠(yuǎn)膜的V結(jié)構(gòu)域和一個(gè)近膜的C2結(jié)構(gòu)域，隨后是跨膜區(qū)和胞漿區(qū)［11－12］。胞外區(qū)具有 N－連接糖基化位點(diǎn)，胞內(nèi)區(qū)具有3個(gè)保守的酪氨酸基序［13］。本試驗(yàn)序列分析結(jié)果也證實(shí)比格犬SLAM具有信號(hào)肽區(qū)、跨膜區(qū)、糖基化位點(diǎn)和3個(gè)保守的酪氨酸基序，和報(bào)道的受體類(lèi)型相似。

CDV主要是通過(guò)病毒的血凝素蛋白H和宿主細(xì)胞受體的SLAM相互作用，而侵入感染細(xì)胞內(nèi)部［14］。因?yàn)镾LAM主要分布于淋巴細(xì)胞表面，所以感染經(jīng)常造成患病動(dòng)物的淋巴組織或器官損害，最終導(dǎo)致患病動(dòng)物免疫抑制和繼發(fā)感染［15］。通過(guò)對(duì)犬瘟熱病毒細(xì)胞受體的序列結(jié)構(gòu)特征分析，為進(jìn)一步構(gòu)建體外表達(dá)犬SLAM的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

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