何冬明 嚴(yán)善春 魯藝芳

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

在自然界，植物要面臨病菌侵染、昆蟲(chóng)取食等一系列來(lái)自外界的壓力，為了適應(yīng)這種生態(tài)壓力，植物形成了復(fù)雜的防御體系［1］。其中，過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)都是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶［2－3］，它們可以催化有機(jī)物，能夠產(chǎn)生毒害昆蟲(chóng)的防御物質(zhì)，從而有效地抵御害蟲(chóng)的侵襲［4－5］，保證植株健康生長(zhǎng)。黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)又稱黃波欏，為蕓香科的闊葉喬木，是東北三大硬闊之一。一直以來(lái)很少有關(guān)于黃檗病蟲(chóng)害大發(fā)生和危害的報(bào)道。在本研究的樣品采集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，黃檗遭到黃波欏麗木虱(Calophiya nigra Kuwayama)［6］的侵襲，造成大量葉片萎縮潰爛。哈爾濱松樂(lè)公園內(nèi)黃檗人工混交林，麗木虱對(duì)其雌、雄株的危害率:7月份，分別為89.46%和67.31%;8月份，分別為65.93%和42.85%;6月份，危害率最低，分別為21.53%和12.97%。東北林業(yè)大學(xué)哈爾濱實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)內(nèi)黃檗人工混交林，麗木虱對(duì)雌、雄株的危害率;7月份，分別為93.62%和75.47%;8 月份，分別為 79.31%和 52.11%;6 月份，危害率最低，分別為30.77%和19.84%。由此可見(jiàn)，黃檗并非能抵御所有害蟲(chóng)，且不同月份的危害程度有明顯差別。目前，國(guó)內(nèi)外眾多科研工作者對(duì)植物抗性與酶活關(guān)系的研究，大多是在脅迫條件下分析各種保護(hù)酶活性變化［7－10］，而對(duì)自然條件下林木保護(hù)酶與抗性關(guān)系的研究較少，對(duì)黃檗的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要研究生長(zhǎng)時(shí)期和健康狀況對(duì)黃檗葉片內(nèi)保護(hù)酶活性的影響，探索黃檗組成抗性防御機(jī)制，為黃檗人工林的有效管理和害蟲(chóng)防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)選在哈爾濱松樂(lè)公園和東北林業(yè)大學(xué)哈爾濱實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，黃檗均為人工混交林。松樂(lè)公園位于黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)，黃檗平均樹(shù)齡為37 a，郁閉度為0.6左右，林內(nèi)有白樺、榆樹(shù)等喬木，紫丁香、榆葉梅等灌木。東北林業(yè)大學(xué)哈爾濱實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)位于哈爾濱市南崗區(qū)，黃檗平均樹(shù)齡為56 a，郁閉度在0.7左右，林內(nèi)有樟子松、蒙古櫟、榆樹(shù)等喬木，烏蘇里鼠李、暖木條莢蒾等灌木。2塊樣地立地條件相似。分別在6、7、8月每月月底，在2塊樣地隨機(jī)抽取健康和受害的黃檗雌雄各6株，在每株樣樹(shù)樹(shù)冠的上、中、下3個(gè)層次的東、南、西、北4個(gè)方向，即12個(gè)方位采摘葉片，將同株樣樹(shù)上所采摘的葉片充分混合裝入夾鏈袋內(nèi)，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰柜中，－40℃保存，待測(cè)。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 CAT 活性測(cè)定

酶液的提取:稱取1.0 g鮮樣，液氮研磨，加入6 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.8);冰浴研磨至勻漿，4℃下，10 000 r/min離心10 min，取上清液為酶提液。

活性測(cè)定:參照王晶英的過(guò)氧化氫氧化法［11］82－83。取40 μL酶提液，加入2.5mL 0.05mol/L磷酸緩沖液和1mL蒸餾水，設(shè)置不加酶液為對(duì)照。反應(yīng)體系在30℃水浴中保溫10 min后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L 的 H2O2，于240 nm 下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)OD240變化0.1的酶量為1個(gè)酶活力單位(U·g－1)。

1.2.2 POD 活性測(cè)定

酶液的提取:稱取1.0 g鮮樣，液氮研磨，加入6 mL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液(pH=6.0，每 100 mL 含 0.1 g PVP)，冰浴研磨至勻漿，4℃下，10 000 r/min離心10 min，取上清液為酶提液。

活性測(cè)定:參照李合生［12］的愈創(chuàng)木酚法。取100 μL酶提液，加入2.9 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液和 1 mL 0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚，設(shè)置不加酶液為對(duì)照。反應(yīng)體系在30℃水浴中保溫30 min后，逐管加入1 mL 0.8%H2O2終止反應(yīng)(測(cè)的時(shí)候現(xiàn)加)，于470 nm下測(cè)定吸光度，以1 min內(nèi)OD470變化0.01的酶量為1個(gè)酶活力單位(U·g－1)。

1.2.3 SOD 活力測(cè)定

酶液的提取:稱取1.0 g鮮樣，液氮研磨，加入6 mL 1/15 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.8)，冰浴研磨至勻漿，4℃下，10 000 r/min離心10 min，取上清液為酶提液。

活性測(cè)定:參照王晶英的氮藍(lán)四唑染色法［11］136－138，略有改動(dòng)。樣品值(光照):100 μL酶提液加3 mL反應(yīng)液(0.05 mol/L磷酸緩沖液);最大光化值(光照):100 μL緩沖液加3 mL反應(yīng)液;對(duì)照(暗處;調(diào)零):100 μL緩沖液加3 mL反應(yīng)液。反應(yīng)體系在4 000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，對(duì)照置于暗處，于560 nm下測(cè)定吸光度，以將氮藍(lán)四唑(NBT)的還原抑制到50%時(shí)所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U·g－1)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理使用SPSS16.0軟件，采用Univariate模型對(duì)生長(zhǎng)時(shí)期和健康狀況進(jìn)行交互效應(yīng)分析(α=0.05或α=0.01);以O(shè)ne－Way ANOVA(單向方差分析法)和Paired－Sample T Test(配對(duì)樣本t檢驗(yàn))進(jìn)行差異顯著性分析，以最小差異顯著法LSD對(duì)生長(zhǎng)時(shí)期和健康狀況的影響進(jìn)行多重比較分析。所有統(tǒng)計(jì)比較n=6。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)時(shí)期及健康狀況對(duì)黃檗葉片內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

從表1可看出，生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)CAT、POD和SOD的活性影響差異均極顯著(p＜0.01)，健康狀況對(duì)CAT、POD和SOD的活性影響不顯著(p＞0.05)。

表1 影響葉片內(nèi)保護(hù)酶活性變化的主效應(yīng)分析檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 健康和受害的黃檗葉片內(nèi)CAT活性的時(shí)序變化

從表2中可看出，不同樹(shù)齡的健康和受害黃檗雌、雄株葉片內(nèi)CAT的活性大小依次為7月份、8月份、6月份，且7月份均與6、8月差異極顯著(p＜0.01)，而健康和受害的葉片內(nèi)CAT活性之間差異均不顯著(p＞0.05)。

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期健康和受害的黃檗葉片內(nèi)CAT活性的時(shí)序變化 U·g－1min－1

2.3 健康和受害的黃檗葉片內(nèi)POD活性的時(shí)序變化

從表3中可看出，不同樹(shù)齡的健康和受害黃檗雌、雄葉片內(nèi)POD的活性均表現(xiàn)為7月份＞8月份＞6月份。黃檗葉片內(nèi)POD的活性，37年生的受害雌株及56年生的健康和受害雌株，7月份均與6月和8月差異極顯著(p＜0.01);37年生的健康雌雄株及56年生的健康雄株，6月份均與7月和8月差異極顯著(p＜0.01);37年生和56年生的受害雄株，6月、7月和8月之間差異均極顯著(p＜0.01)。健康和受害的葉片之間，7月份差異顯著(p＜0.05)，而在6月份和8月份差異均不顯著(p＞0.05)。

表3 不同生長(zhǎng)時(shí)期健康和受害的黃檗葉片內(nèi)POD活性的時(shí)序變化 U·g－1min－1

2.4 健康和受害的黃檗葉片內(nèi)SOD活性的時(shí)序變化

從表4中可看出，不同樹(shù)齡的健康和受害黃檗雌、雄葉片內(nèi)SOD的活性由大到小依次為7月份、8月份、6月份。黃檗葉片內(nèi)SOD的活性，37年生和56年生的健康雌株，6月份與7月和8月差異極顯著(p＜0.01);37年生的健康雄株、受害雌雄株及56年生的受害雌株，6月、7月和8月份之間差異均極顯著(p＜0.01);56年生的健康和受害雄株，7月份與6月和8月差異極顯著(p＜0.01);健康和受害葉片之間在各個(gè)月份差異均不顯著(p＞0.05)。

表4 不同生長(zhǎng)時(shí)期健康和受害的黃檗葉片內(nèi)SOD活性的時(shí)序變化 U·g－1

3 結(jié)束語(yǔ)

植物和昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中不斷相互作用，彼此形成了許多防御及適應(yīng)機(jī)制［13］。黃波欏麗木虱1 a發(fā)生3代，6月為第1代若蟲(chóng)危害期，7月為第2代若蟲(chóng)危害期，8月為第3代若蟲(chóng)危害期，7月下旬，隨著個(gè)體數(shù)量的不斷增加，若蟲(chóng)排泄的大量蜜露及由此滋生的煤污病造成60%的若蟲(chóng)死亡［6］，使第3代若蟲(chóng)數(shù)量大幅度降低。本研究結(jié)果表明健康和受害的黃檗葉片內(nèi)CAT、POD和SOD的活性均表現(xiàn)為7月份＞8月份＞6月份，這種變化與其害蟲(chóng)黃波欏麗木虱的種群數(shù)量變化趨勢(shì)相吻合。說(shuō)明黃檗為抵御麗木虱的危害，在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的隨時(shí)序調(diào)整抗蟲(chóng)性的機(jī)制。

植物對(duì)昆蟲(chóng)的防御是通過(guò)物理防御和化學(xué)防御共同實(shí)現(xiàn)的［14］，害蟲(chóng)的脅迫能引起植物生理的應(yīng)激反應(yīng)［15］，而應(yīng)激反應(yīng)可表現(xiàn)為保護(hù)酶活力的變化［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康和受害的黃檗葉片內(nèi)保護(hù)酶的活性，POD只有在7月份差異顯著(p＜0.05)，其在6月和8月以及CAT和SOD在各個(gè)月份差異均不顯著(p＞0.05)。這說(shuō)明黃檗誘導(dǎo)抗性機(jī)制較差，誘導(dǎo)防御不是其自身保護(hù)的主要措施。

［1］Lacy S，Thomas L B，Sullivan T J.Effects of methyl jasmonate and an endophytic fungus on plant resistance to insect herbivores［J］.Journal of Chemical Ecology，2008，34(12):1511 －1517.

［2］陳祖靜，曹支敏，茍興慶，等.楊樹(shù)與松楊柵銹菌互作中寄主活性氧及抗性相關(guān)酶變化［J］.林業(yè)科學(xué)，2010，46(8):101 －106.

［3］Vatankhah E，Niknam V，Ebrahimzadeh H.Activity of antioxidant enzyme during in vitro organogenesis in Crocus sativus［J］.Biologia Plantarum，2010，54(3):509 －514.

［4］Yordanova R Y，Christov K N，Popova L P.Antioxidative enzymes in barley plants subjected to soil flooding［J］.Environmental and Experimental Botany，2004，51(2):93 －101.

［5］Wang Zunsheng，Gu Yuxiang，Yuan Qinsheng.Effect of nutrition factors on the synthesis of superoxide dismutase，catalase，and membrane lipid peroxide levels in Cordyceps militaris Mycelium［J］.Current Microbiology，2006，52(1):74 －79.

［6］許雄山，侯愛(ài)菊，劉景全.黃波欏麗木虱的初步研究［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，19(?？?:197 －208.

［7］徐興友，王子華，張風(fēng)娟，等.干旱脅迫對(duì)6種野生耐旱花卉幼苗根系保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2008，44(2):41 －47.

［8］李躍強(qiáng)，宣維健，盛承發(fā).大強(qiáng)度去葉對(duì)棉花葉綠素和保護(hù)酶系的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26(3):830 －836.

［9］Li Dongxiao，Li Cundong，Sun Hongchun，et al.Effects of drought on soluble protein content and protective enzyme system in cotton leaves［J］.Frontiers of Agriculture in China，2010，4(1):56 －62.

［10］Ren Yinghong.Protective enzyme activity and physiological properties of fourmulberry varieties affected by drought stress in the Panxi Region of Sichuan Province，China［J］.Forestry Studies in China，2009，11(3):190 －195.

［11］王晶英，敖紅，張杰，等.植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理［M］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社，2003.

［12］李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000:164－169.

［13］彭金英.植物和昆蟲(chóng)相互關(guān)系:植物對(duì)植食性昆蟲(chóng)的防御反應(yīng)和昆蟲(chóng)的生理適應(yīng)［D］.上海:中國(guó)科學(xué)院研究生院(上海生命科學(xué)研究院)，2005.

［14］Revandy I D，Mahmood M，Mohd R I，et al.Responses of the antioxidative enzymes in Malaysian rice(Oryza sativa L.)cultivars under submergence condition［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2010，32(4):739 －747.

［15］Kaarina P，Jyrki P，Katja K，et al.Genotypic variation in growth and resistance to insect herbivory in silver birch(Betula pendula)seedlings［J］.Oecologia，2003，137(4):572 －577.

［16］Zhang Shize，Hua Baozhen，Zhang Fan.Induction of the activities of antioxidative enzymes and the levels of malondialdehyde in cucumber seedlings as a consequence of Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)infestation［J］.Arthropod-Plant Interactions，2008，2(4):209－213.