宋琳亮，傅江南

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

忍冬科接骨木屬Sambucus Linn.植物約20余種，多個(gè)國(guó)家都有將該屬植物用作草藥的記載［1－2］，療效包括抗癌［3］、消炎［4］、利尿［5］及促進(jìn)骨折愈合［6］等等。接骨木多糖(Sambucus polysaccharides，SP)是從接骨木莖中分離提取的活性成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接骨木多糖對(duì)于鏈脲菌素致糖尿病大鼠模型具有明顯的降糖作用，同時(shí)血漿內(nèi)高密度脂蛋白水平明顯升高［7］。本研究將進(jìn)一步采用體外培養(yǎng)研究接骨木多糖對(duì)胰島細(xì)胞活性的影響及對(duì)四氧嘧啶致胰島細(xì)胞損傷的作用，以及接骨木多糖對(duì)胰島細(xì)胞分泌胰島素功能的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞INS-1E細(xì)胞由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco BRL公司;新生牛血清購(gòu)自Hyclone公司;CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo;大鼠胰島素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Mercodia公司;其他試劑均購(gòu)自Sigma。Bio-Tek ELX 800酶標(biāo)儀(美國(guó));REVCO CO2培養(yǎng)箱(美國(guó))。

1.3 接骨木多糖的制備接骨木多糖提取自接骨木莖，提取流程簡(jiǎn)述為接骨木莖粉碎烘干—乙醚脫脂—熱水浸提—抽濾—乙醇沉淀—離心分離—水溶解—脫蛋白脫色—旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮—DEAE Sepharose Fast Flow層析—穿過(guò)液凍干。

1.4胰島細(xì)胞的培養(yǎng)INS-1E細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)液、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中包含1 mmol·L－1丙酮酸鈉、5.6 mmol·L－1萄萄糖、10%胎牛血清(FBS)、10 mmol·L－1HEPES、2 mmol·L－1L-谷氨酰胺、50 μmol·L－1β-巰基乙醇、100 U·ml－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素。接種密度為6×108·L－1，每2天更換1次培養(yǎng)基。

1.5胰島細(xì)胞活性檢測(cè)培養(yǎng)液中接骨木多糖濃度分別為 50、100、200、400、800 mg·L－1，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天檢測(cè)細(xì)胞活性，持續(xù)5 d。每孔加入10 μl CCK-8試劑，置細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度，參比波長(zhǎng)530 nm。

1.6接骨木多糖對(duì)四氧嘧啶致胰島細(xì)胞損傷的影響將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、四氧嘧啶組和多糖組，培養(yǎng)48 h后，多糖組分別加入不同濃度的多糖溶液，使其終濃度分別為 50、100、200、400、800 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，四氧嘧啶組和多糖組分別加入四氧嘧啶溶液，使其終濃度為4 mmol·L－1，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h，然后如上檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.7 接骨木多糖對(duì)胰島細(xì)胞的促胰島素分泌作用

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組:① 5.6 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;② 16.7 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;③ 4 mmol·L－1四氧嘧啶 +2.7 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;④ 4 mmol·L－1四氧嘧啶 +16.7 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;多糖溶液濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg·L－1。培養(yǎng)24 h后，用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液(KRBB:129 mmol·L－1NaCl、4.8 mmol·L－1KCl、1.2 mmol·L－1MgSO4、1.2 mmol·L－1KH2PO4、2.5 mmol· L－1CaCl2、5 mmol· L－1NaHCO3、0.1%BSA 和10 mmol·L－1HEPES，pH 7.4)洗滌細(xì)胞，隨后在KRBB緩沖液中加入葡萄糖、丙酮酸鈉或氯化鉀培養(yǎng)30 min。收集上清液，于－20℃凍存。

再用Hanks液洗滌3次，加入裂解液裂解細(xì)胞(50 mmol·L－1HEPES、0.1%(V/V)Triton X-100、1 mmol·L－1PMSF、10 mmol·L－1E-64、10 mmol·L－1pepstatin A、10 mmol·L－1TLCK、100 mmol·L－1leueptin，pH 8.0)，收集，于 －20℃凍存。用酶聯(lián)免疫試劑盒(Mercodia AB Sweden)450 nm檢測(cè)胰島素濃度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析文中進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)均為6次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，one-way ANOVA和鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的多重比較。

2 結(jié)果

2.1接骨木多糖對(duì)胰島細(xì)胞活性的影響檢測(cè)接骨木多糖處理后大鼠胰島細(xì)胞增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 1)，在試驗(yàn)濃度范圍(50 ～800 mg·L－1)內(nèi)，處理組細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。從接骨木多糖處理后d 1～5，100 mg·L－1濃度對(duì)大鼠胰島細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)，之后隨著濃度增加，促進(jìn)作用減弱。

Fig 1 Effects of Sambucus polysaccharides treatment in different concentrations on the cell viability in 5 days

2.2接骨木多糖對(duì)四氧嘧啶致胰島細(xì)胞損傷的影響不同濃度接骨木多糖處理4 h后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入4 mmol·L－1四氧嘧啶，誘導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷。四氧嘧啶作用20 h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。如Fig 2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與四氧嘧啶單獨(dú)處理組相比，不同濃度(50～800 mg·L－1)接骨木多糖處理組都表現(xiàn)出了較高的細(xì)胞活性，其中100、200和400 mg·L－1處理組的細(xì)胞活性明顯高于四氧嘧啶組(P＜0.05)，隨著處理濃度增加，細(xì)胞活性增加，200 mg·L－1接骨木多糖濃度下的細(xì)胞活性最高，之后隨著處理濃度增加細(xì)胞活性降低。

Fig 2 Effects of Sambucus polysaccharides treatment in different concentrations on the cell viability induced damage with alloxan

2.3接骨木多糖對(duì)胰島細(xì)胞促胰島素分泌作用的影響在處理組培養(yǎng)液中加入不同濃度的接骨木多糖，培養(yǎng)24 h后，再分別用低濃度葡萄糖和高濃度葡萄糖刺激大鼠胰島細(xì)胞分泌胰島素，檢測(cè)胰島素濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5.6 mmol·L－1低糖條件下，與對(duì)照組相比50 mg·L－1接骨木多糖對(duì)胰島素分泌沒(méi)有明顯影響，而其它4個(gè)濃度(100、200、400、800 mg·L－1)處理都明顯降低了胰島素釋放量。而在16.7 mmol·L－1高糖條件下，50 mg·L－1接骨木多糖對(duì)胰島素分泌沒(méi)有明顯影響，但其它4個(gè)濃度(100，200，400，800 mg·L－1)處理都明顯增加了胰島素釋放量，200 mg·L－1和 400 mg·L－1兩個(gè)處理組胰島素釋放最高(Tab 1)。

Tab 1 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in INS-1E cells(±s，n=6)

Tab 1 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in INS-1E cells(±s，n=6)

*P＜0.05 vs contorl

Group Dose/mg·L－1 Insulin secretion at different concentration glucose/mU·g－1Pro 5.6 mmol·L －1glucose 16.7 mmol·L －1glucose Control 12.49 ±0.38 50.63 ±2.35 SP 50 12.59 ±0.31 51.55 ±2.49 100 11.95 ±0.36* 59.01 ±2.95*200 10.88 ±0.41* 67.99 ±2.09*400 11.16 ±0.29* 66.31 ±4.03*800 11.04 ±0.14* 60.78 ±2.88*

Tab 2 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in alloxan damaged INS-1E cells(±s，n=6)

Tab 2 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in alloxan damaged INS-1E cells(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs alloxan

Group Insulin secretion at different concentration glucose/mU·g－1Pro 5.6 mmol·L －1 glucose 16.7 mmol·L －1 glucose Control 9.64 ±0.14 45.50 ±2.98 4 mmol·L －1alloxan 5.81 ±0.13* 25.44 ±2.37*50 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 5.99 ±0.09*# 26.71 ±1.69*100 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 6.94 ±0.10*# 28.22 ±1.91*#200 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 7.34 ±0.19*# 32.76 ±2.40*#400 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 7.57 ±0.11*# 31.74 ±1.43*#800 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 7.00 ±0.20*# 30.95 ±1.39*#

再用四氧嘧啶誘導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷后，進(jìn)行低糖和高糖刺激，檢測(cè)各組胰島素濃度。發(fā)現(xiàn)不論是高糖誘導(dǎo)組還是低糖誘導(dǎo)組，接骨木多糖預(yù)處理后胰島素分泌量都高于四氧嘧啶組。

3 討論

本研究分析了不同濃度接骨木多糖對(duì)胰島細(xì)胞細(xì)胞活性和胰島素釋放的影響。結(jié)果表明，接骨木多糖可以促進(jìn)INS-1E胰島細(xì)胞增殖，并且該促進(jìn)作用與濃度相關(guān)，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，100 mg·L－1濃度對(duì)大鼠胰島細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)。四氧嘧啶對(duì)胰島β細(xì)胞具有特殊的破壞作用，可以中止胰島素分泌。本實(shí)驗(yàn)中，我們用四氧嘧啶處理接骨木多糖處理后的胰島細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)四氧嘧啶對(duì)胰島細(xì)胞活性具有明顯的抑制作用，可以損傷胰島細(xì)胞，而接骨木多糖處理在一定程度上可以減輕這一損傷，其中以200 mg·L－1的作用效果最佳。

胰島細(xì)胞可分泌胰島素，胰島素分泌降低表明胰島細(xì)胞功能受損。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接骨木多糖可以抑制低糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)胰島細(xì)胞分泌胰島素。對(duì)于四氧嘧啶誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞損傷、胰島素分泌減少，接骨木多糖也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。這一結(jié)果與王丹蕊等［7］得到的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，表明接骨木多糖是通過(guò)調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能達(dá)到降糖作用的。

接骨木多糖的具體作用機(jī)制需要深入研究，并對(duì)接骨木多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定和解析。

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