張飛春，孫文革，高曉玲，石 玫，王延峰，戴建華

(河北省石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

蟾酥的抗腫瘤有效成分多為脂溶性化合物，其中脂蟾毒配基、蟾毒靈、華蟾酥毒基含量較多、活性較強(qiáng)，且具有高效低毒的特點(diǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，80%乙醇加熱回流提取所得的華蟾酥毒基和脂蟾毒配基成分的含量最高[2]。為此，筆者采用80%乙醇提取蟾酥，并制備成不同質(zhì)量濃度的提取物，與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)，探討蟾蜍乙醇提取物的最佳抑瘤濃度?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

蟾酥(批號(hào)為20100322，石家莊樂仁堂醫(yī)藥公司);華蟾酥毒基對(duì)照品(批號(hào)為110803－200504)，脂蟾毒配基對(duì)照品(批號(hào)為110718－200507)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;1640培養(yǎng)基(GIMCO公司);小牛血清(四季青公司);噻唑藍(lán)(MTT)試劑(美國(guó)Sigma公司);其他試劑均為分析純;SW480細(xì)胞株(由河北醫(yī)大四院科研中心贈(zèng)送)。HT2型酶標(biāo)儀 (奧地利Anthos公司)。

1.2 方法

1.2.1 蟾酥乙醇提取物制備

取蟾酥10 g，粉碎成細(xì)粉，置索氏提取器，加80%乙醇200 mL，加熱提取3 h，濾過(guò)，濾液蒸干。

1.2.2 薄層色譜分析[3]

取上蟾酥提取物0.2 g，加乙醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加乙醇1 mL作為供試品溶液。另取蟾酥對(duì)照藥材0.2 g，加乙醇10 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取脂蟾毒配基及華蟾酥毒基對(duì)照品，加乙醇分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷 －氯仿 －丙酮(4∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.3 蟾酥制劑

已有研究表明，蟾毒配基組合物油水分配系數(shù)較大，為典型的疏水性產(chǎn)物，可加入表面活性劑增溶以利于注射劑成型[4]。故應(yīng)用不同成分的蒸餾水－甘油－吐溫－80水包油型乳化劑，對(duì)蟾酥乙醇提取物的溶解所需乳化劑比例進(jìn)行初步試驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與MTT檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 SW480細(xì)胞，計(jì)數(shù)后鋪96孔板，6×103個(gè)細(xì)胞 /孔，每孔加含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基至200 μL。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃和5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加藥(蟾酥提取物)，藥物濃度分別為160，80 ，40 ，20，10 ，5 ，2 ，1 μg/mL，設(shè) 5 個(gè)副孔，使每孔體積為 300 μL。24 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以只加培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿為空白對(duì)照組。

1.2.5 結(jié)果分析

細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光吸收值÷對(duì)照組光吸收值×100%。應(yīng)用Microsoft excel軟件用細(xì)胞存活率對(duì)劑量對(duì)數(shù)作圖并按作圖法求出半數(shù)有效劑量(IC50)值。

2 結(jié)果

2.1 蟾酥乙醇提取物性狀

取蟾酥10 g，可得到5 g黃棕色粉末狀蟾酥提取物。

2.2 薄層色譜分析結(jié)果

經(jīng)薄層色譜分析，在供試品溶液色譜中，與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的1個(gè)綠色及1個(gè)紅色斑點(diǎn)(圖1)。

2.3 乳化劑成分比例

蟾酥乙醇提取物不溶于水，經(jīng)過(guò)多次調(diào)試，以蒸餾水∶甘油∶吐溫－80∶藥粉=90∶9∶1∶1作為乳化劑，可使蟾酥乙醇提取物完全溶解，制成澄清溶液，有利于抗腫瘤體外試驗(yàn)。

2.4 蟾酥提取物抑制腫瘤的MTT測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見表1。

2.5 不同蟾酥提取物質(zhì)量濃度下細(xì)胞存活率及 IC50值

結(jié)果見圖2?？梢?，蟾酥乙醇提取物體外抑制腫瘤細(xì)胞的IC50=3.488 μg/mL。

圖1 蟾酥提取物薄層色譜圖

表1 蟾酥提取物抑制腫瘤的MTT測(cè)定結(jié)果(OD值)

圖2 不同蟾酥提取物質(zhì)量濃度下腫瘤細(xì)胞的存活率

3 討論

已有很多研究表明，蟾酥具有抗腫瘤作用，其抗腫瘤有效成分多為脂溶性化合物。從市售蟾酥中提取抗腫瘤有效成分并進(jìn)一步研究其抗腫瘤劑量效應(yīng)關(guān)系，涉及蟾酥脂溶性成分提取方法、溶劑選擇及腫瘤細(xì)胞藥物敏感性試驗(yàn)3個(gè)方面的問題。本初步研究表明，采用80%乙醇加熱回流法可有效提取市售蟾酥中的脂溶性抗腫瘤成分，應(yīng)用水包油性溶劑可使蟾酥脂溶性提取物較好地溶于溶劑中且有利于腫瘤藥物敏感性試驗(yàn);蟾酥脂溶性抗腫瘤成分抗腫瘤效應(yīng)呈劑量依賴性，IC50約為3.488 μg/mL。

[1]王 濤，李 芳，姜維剛，等.蟾蜍脂質(zhì)微球注射液的制備及其滅菌穩(wěn)定性[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，4(25):249－254.

[2]袁旭江，沈嘉茵，朱盛山.不同提取方法對(duì)蟾蜍有效成分的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008(5):66－67.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:79－88.

[4]劉 丹，奉建芳.蟾蜍中3種蟾毒配基組合物的表觀溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(11):1 256－1 258.