徐琦煜 劉佳明 周鐵麗 楊新東 羅新華

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325000;2.溫州醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035)

標(biāo)本發(fā)霉一直是醫(yī)學(xué)教學(xué)、臨床病理檢驗和法醫(yī)等工作中遇到的棘手問題,目前所用的尸體標(biāo)本通常經(jīng)防腐固定處理后,浸泡于5%福爾馬林(主要成分為甲醛)溶液中進行濕保存,防腐效果雖好,但對人體黏膜的刺激大,直接損害醫(yī)學(xué)教學(xué)者和臨床工作者及醫(yī)學(xué)生的身體健康,并污染周圍環(huán)境,而且在使用過程中,會出現(xiàn)標(biāo)本外露部分霉變的情況,液面也會出現(xiàn)一層薄而透明的霉膜。尸體標(biāo)本一旦霉變,再用甲醛殺菌,尤其是霉菌,效果不佳。霉變的標(biāo)本給教學(xué)、臨床和科研帶來了諸多影響,使其失去使用價值,而且霉斑還影響外觀,長時間、大量接觸霉菌也會危害身體健康。本課題組研制了一種以天然抗菌劑殼聚糖及其衍生物[1-2]為主要成分的新型尸體標(biāo)本保存液代替甲醛保存標(biāo)本。為了了解新型保存液的保存效果,作者對霉變尸體標(biāo)本中的霉菌進行分離鑒定,了解尸體標(biāo)本霉變的優(yōu)勢霉菌,并對傳統(tǒng)甲醛保存液與新型標(biāo)本保存液的防霉效果進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)新型標(biāo)本保存液的主要成分:殼聚糖,雙乙酸鹽,Na2EDTA,氯化鈉,甘油;(2)標(biāo)本來源:溫州醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)實驗室的尸體標(biāo)本,高溫30℃、濕度90%條件下存放一段時間,定期觀察,當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)霉變時,取樣進行霉菌的分離鑒定;(3)霉菌分離培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基均參照文獻[3]配制;(4)主要試劑:真菌總DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司,Taq酶和dNTP購至天根生化科技(北京)有限公司,引物ITS1和ITS2由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 尸體標(biāo)本霉菌的分離、純化 無菌拭子采集霉變樣本接種于霉菌培養(yǎng)基中,置30℃孵箱中培養(yǎng),第2天起觀察菌落生長情況,挑取可疑菌落,涂片染色進行初步鑒定,并用選擇性培養(yǎng)基再次進行純化培養(yǎng),并將純化的菌株轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng),充分產(chǎn)孢后冷藏備用。

1.2.2 尸體標(biāo)本中霉菌的鑒定 分離、純化的霉菌采取形態(tài)學(xué)方法,結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進行鑒定[3-4]。(1)菌落形態(tài)特征觀察和培養(yǎng)特征:直接挑取霉菌的菌絲體及孢子制片鏡檢,或用玻片培養(yǎng)法連續(xù)鏡檢,描述霉菌的培養(yǎng)性狀、菌落特征、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等;(2)ITS rDNA鑒定:將篩選菌株的孢子接入PDB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床培養(yǎng)24小時,過濾獲得菌絲,提取真菌基因組總DNA,用引物為ITS1和ITS2擴增18S rDNA和5.8S rDNA之間的序列,PCR擴增產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序后,將獲得的DNA序列輸入GenBank,用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行比較分析,確定霉菌種類。

1.2.3 微生物致霉(腐)性測定 把分離到的主要

致霉菌分別接種到新鮮的尸體標(biāo)本上,然后分別放入帶有 30mL無菌水的滅菌三角瓶中密封,置于28℃下培養(yǎng),以接種無菌培養(yǎng)基為對照,觀察微生物對尸體標(biāo)本有無致霉(腐)性。

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 保存液殺菌性能評價 采用紙片抑菌法比較自制尸體保存液和傳統(tǒng)保存液的殺菌性能,每個濃度保存液對每種菌各測10次,計算抑菌環(huán)直徑的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;瓊脂稀釋法檢測新型保存液對三種主要致霉菌的最低抑菌濃度。

1.3.2 保存液防霉性能穩(wěn)定性評價 采用紙片抑菌法檢測使用中的保存液的抑菌效果,并觀察保存液的性狀。

1.3.3 新型保存液安全性能評價 通過小鼠灌胃和兔子皮膚、耳朵、眼結(jié)膜接觸試驗評價新型保存液的安全性能。

2 結(jié) 果

2.1 霉菌的分離、純化和鑒定結(jié)果 60多份尸體標(biāo)本霉變樣本進行分離、純化,共得到209株菌,保存在PDA斜面上,出現(xiàn)頻率較高的三株霉菌菌株,編號分別為WZ-01、WZ-02和WZ-03。根據(jù)形態(tài)特征、序列同源性以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果,參考《中國真菌志》(第5卷)、《真菌鑒定手冊》等,初步鑒定WZ-01為木霉菌屬(Trichoderma sp)、WZ-02為曲霉屬(Aspergillus sp)、WZ-03為鐮孢菌屬(Fusarium sp)。

2.2 微生物致霉(腐)性 三株霉菌均具有對新鮮尸體標(biāo)本的致霉(腐)性,致霉速度較快、程度較重。

2.3 新型標(biāo)本保存液抑菌效果評價

2.3.1 新型標(biāo)本保存液與傳統(tǒng)標(biāo)本保存液的抑菌效果比較,見表1。新型標(biāo)本保存液與福爾馬林保存液比較,無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 兩種防霉劑抑菌環(huán)直徑比較(,單位:mm,n=10)

表1 兩種防霉劑抑菌環(huán)直徑比較(,單位:mm,n=10)

新型保存液濃度(%)福爾馬林保存液濃度(%)菌 種0.05 0.1 0.20.05 0.1 0.2 WZ-0135±1.240±1.345±1.0 40±1.643±1.348±1.8 WZ-0234±1.238±1.539±1.6 32±1.137±1.638±1.8 WZ-0322±0.822±1.124±0.9 25±1.226±1.126±0.9

2.3.2 新型保存液對三種主要致霉菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為:WZ-01:＜0.0125μ g/mL,WZ-02:＜0.0125μ g/mL,WZ-03:0.025μ g/mL。

圖1a-1c 已使用半年的新型保存液的抑菌效果圖

2.4 新型保存液防霉性能穩(wěn)定性檢測結(jié)果 使用半年的保存液仍具有明顯的防霉效果,具有抑制或殺死三種主要致霉菌作用(見圖1a～1c),其抑菌環(huán)直徑與新配保存液基本相同,并且保存液一直清澈透明,在保存缸和箱內(nèi)的液面和內(nèi)壁均未發(fā)現(xiàn)霉點。

2.5 新型保存液的安全性 新型保存液對小鼠的最小致死量為(LD50)＞3600mg/kg,根據(jù)化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn),新型保存液為低毒類且具有很好的使用安全性。小鼠急性毒性試驗結(jié)果顯示小鼠灌胃給藥后,無叫聲異常、震顫、驚厥、運動失調(diào)、流涎、流淚、流鼻涕、呼吸困難、腹瀉等現(xiàn)象發(fā)生。兔子皮膚、耳朵、眼結(jié)膜接觸試驗結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)兔子皮膚、耳朵有異常表現(xiàn),用新型保存液滴眼后1小時,眼結(jié)膜輕度充血,滴眼后6小時充血消失,眼結(jié)膜恢復(fù)正常。說明新型保存液對眼的刺激性很小,可認為對動物眼基本無刺激性。

3 討 論

福爾馬林用于尸體防腐是國際上通用的手段,其他防腐劑雖有零星報道,但都沒有達到福爾馬林的效果。文獻顯示,對尸體標(biāo)本保存材料的探索,主要是解剖工作者在研究[5-6]。本課題組綜合多專業(yè)的知識,開發(fā)出以金屬絡(luò)合劑、蛋白交聯(lián)劑、滲透調(diào)節(jié)劑和食品級防霉防腐劑和水為組份的組合物,其主要成分殼聚糖、Na2EDTA、雙乙酸鹽、氯化鈉、甘油等通過抑菌/殺菌、抗氧化、調(diào)節(jié)滲透壓、保濕等聯(lián)合作用起到防腐防霉效果。

尸體標(biāo)本發(fā)生霉變主要是因為尸體標(biāo)本本身就是霉菌生長的良好基質(zhì),當(dāng)尸體標(biāo)本含水率高于13%,或尸體標(biāo)本相對濕度超過70%時,如尸體標(biāo)本中有霉變微生物存在,在一定溫度條件下,尸體標(biāo)本就有可能發(fā)生霉變。本試驗從大量霉變標(biāo)本中分離出209株霉菌,確定了三種優(yōu)勢的致霉菌,并對其致霉效果進行了驗證。

本研究組對新型標(biāo)本保存液的防霉效果、穩(wěn)定性、安全性等進行評估,結(jié)果表明:新型標(biāo)本保存液與傳統(tǒng)保存液福爾馬林相比,對不同致霉菌的抑菌作用有一定的差異,但總體上均有很好的抑菌效果,新型保存液從保存效果和物理性狀等方面均有很好的穩(wěn)定性且具有較理想的生物安全性。

綜上所述,作者研制出的尸體保存液具有安全無毒、保存效果穩(wěn)定等優(yōu)點,從根本上解決了甲醛對人體的危害及對環(huán)境污染等問題,也能夠滿足教學(xué)和科研的需要。

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