葉愛(ài)芳 陳遲琪 胡曉霞 尹麗慧 吳建波

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325000)

慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,其主要的遺傳學(xué)異常是Ph1染色體形成,產(chǎn)生bcr/abl融合基因,導(dǎo)致白血病細(xì)胞的克隆性增生。目前,檢測(cè)CML遺傳學(xué)和分子生物學(xué)異常的主要方法有染色體核型分析和PCR技術(shù)。而熒光原位雜交技術(shù)(fluorecence in situ hybridization,FISH)以其快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn),正逐步應(yīng)用于各種血液病的檢測(cè),特別是在CML的診斷和隨訪中發(fā)揮了重要的作用,是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的橋梁?，F(xiàn)對(duì)30例(骨髓標(biāo)本43份)CML初診或復(fù)診患者,行普通染色體核型分析和ES型bcr/abl探針FISH分析,探討ES型bcr/abl探針熒光原位雜交技術(shù)在檢測(cè)bcr/abl融合基因中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2009年7月～2010年7月本院行bcr/abl融合基因檢測(cè)的骨髓標(biāo)本43份,涉及患者30例,包括CML初診患者和CML行格列衛(wèi)治療不同階段的患者。男18例,女12例,年齡16～77歲。慢性髓細(xì)胞性白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照張之南[1]的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照5例,為非慢性髓細(xì)胞性的白血病患者。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞染色體培養(yǎng) 染色體培養(yǎng)采用含10%胎牛血清(FBS)、10ng/mL粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)的1640培養(yǎng)液置37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng) 24小時(shí)后,按常規(guī)方法收獲染色體,氣干法滴片,G顯帶,并根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)核型模式圖(ISCN 1995)進(jìn)行核型分析。其余標(biāo)本置冰乙酸:甲醇(1:3)的固定液中,保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 bcr/abl雙色單融合基因探針 選用北京金菩嘉的雙色單融合ES型DNA探針。其中bcr探針為位點(diǎn)特異性探針,雜交于22號(hào)染色體22q11.2,覆蓋主要斷裂點(diǎn)以上的部分bcr基因,熒光信號(hào)為綠色;abl雜交信號(hào)位于9號(hào)染色體9q34,覆蓋整個(gè)abl基因及ass基因,熒光信號(hào)為紅色。探針模式如第236頁(yè)圖1。

1.2.3 FISH流程 制好的玻片在37℃新鮮配制的 RNase A(100μ g/mL)溶液中孵育 60分鐘。室溫下于2×SSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片2次,每次5分鐘。將玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%、85%和100%乙醇中各3分鐘脫水;自然干燥玻片。玻片加熱至56℃。室溫下,將7μ L雜交緩沖液、2μ L探針和1μ L去離子水混合加入小的EP管中,充分混勻。把探針混合物加到玻片的目標(biāo)區(qū)域處,蓋上18mm×18mm的蓋玻片,封片膠封片。把玻片放到雜交儀上熱變性,變性條件為78℃×5分鐘,后在42℃,一定的濕度下雜交過(guò)夜。移去蓋玻片,立即將玻片放入46℃預(yù)熱的2×SSC溶液中,輕微晃動(dòng)玻片,漂洗15分鐘,然后在2×SSC/0.1%NP-40洗液晃動(dòng)5分鐘,后75%乙醇脫水3分鐘,自然干燥玻片。玻片干燥后,將10μ L DAPI復(fù)染劑加于雜交區(qū)域位置,立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20分鐘后,在熒光顯微鏡下Olympus BX-51選用合適的濾光片組觀察玻片。

1.2.4 FISH結(jié)果判斷 正常人骨髓中間期細(xì)胞顯示兩紅(2R)兩綠(2G)熒光信號(hào),分別位于正常的9號(hào)和22號(hào)染色體上。如果bcr/abl融合基因?yàn)橹饕獢嗔讶诤戏绞?則表現(xiàn)為紅-綠-黃-小紅;但是如果患者伴有ass基因的缺失,ass缺失會(huì)帶走abl的一部分基因,那么小紅信號(hào)就會(huì)丟失,表現(xiàn)為紅-綠-黃。如果bcr/abl融合基因?yàn)榇我獢嗔讶诤戏绞?則表現(xiàn)為紅-綠-黃-黃。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)遺傳學(xué)結(jié)果 43份CML初診或復(fù)查患者的骨髓標(biāo)本,6份未做骨髓培養(yǎng),其他培養(yǎng)成功31例,核型分析找到Ph1染色體9例,其中6例CML初診患者都有Ph1染色體,另有1例CML復(fù)查患者多次檢查都發(fā)現(xiàn)21p+染色體異常;6例培養(yǎng)失敗,沒(méi)找到中期分裂相。

2.2 FISH結(jié)果

2.2.1 閾值的建立 5例非慢性髓細(xì)胞性白血病標(biāo)本,每份計(jì)數(shù)200個(gè)間期細(xì)胞,正常間期細(xì)胞顯示為2紅2綠(第236頁(yè)圖2,Fig.1),帶有融合信號(hào)的細(xì)胞顯示為黃色熒光信號(hào)(第236頁(yè)圖2,Fig.2或Fig.3),其值為(3.10 ±1.82)%,帶有(ˉx+3s)判定為bcr/abl融合基因陽(yáng)性,本組即融合信號(hào)＞8.56%為bcr/abl融合基因陽(yáng)性。

2.2.2 結(jié)果 在涉及的30例中,有6例是初診患者,其染色體結(jié)果和FISH一致,都能見(jiàn)到Ph1染色體和bcr/abl融合基因,并且FISH結(jié)果顯示,間期細(xì)胞中融合細(xì)胞的比例達(dá)69.5%～93%。其余患者是確診CML經(jīng)治療后復(fù)查Ph1染色體和bcr/abl融合基因。FISH的具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 30例CML患者的FISH結(jié)果

3 討 論

醫(yī)學(xué)上對(duì)血液病的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)→遺傳學(xué)→分子生物學(xué)的不同階段,最具代表性的例子是發(fā)病率較高的慢性髓細(xì)胞性白血病(CML),目前常規(guī)檢測(cè)中除了骨髓象常規(guī)分析外,還必須做染色體核型分析和融合基因的檢測(cè),因?yàn)?0%以上的CML病例有 t(9;22)(q34;q11.2)易位,產(chǎn)生bcr/abl融合基因[2]。而常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)中,要經(jīng)歷骨髓培養(yǎng)、收獲、滴片、顯帶等步驟,以取得可供分析的中期分裂相,通過(guò)形態(tài)分析來(lái)辨別染色體的異常。但由于白血病細(xì)胞增殖指數(shù)低,較難獲得質(zhì)量好、數(shù)目多的中期分裂相,因而限制了異常染色體的檢出率。本研究中30例患者的43份骨髓標(biāo)本中,未做骨髓培養(yǎng)的6份,其余37份都做了染色體核型分析,共有9份標(biāo)本骨髓標(biāo)本發(fā)現(xiàn)Ph1染色體,包括6份CML初診患者和3份治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的復(fù)發(fā)的患者,6份未找到可供分析的中期分裂相,其余標(biāo)本則是Ph1染色體陰性。由此可見(jiàn),常規(guī)的染色體核型分析對(duì)于初診患者檢出率較高,但不能定義陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量;而且對(duì)復(fù)診病例,由于治療后骨髓的有核細(xì)胞數(shù)很少,不易獲得理想的中期分裂相,導(dǎo)致異常染色體的檢出率不是很高。FISH技術(shù)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速、不受中期分裂像限制等優(yōu)點(diǎn),而且還能揭示某些肉眼不能辨別的基因缺失和染色體斷裂,正逐步應(yīng)用于染色體特殊異常的檢測(cè)。ES型bcr/abl探針是一種雙色單融合探針,紅色信號(hào)標(biāo)記于9號(hào)染色體9q34,覆蓋整個(gè)abl基因及ass基因,綠色熒光信號(hào)標(biāo)記于 22號(hào)染色體22q11.2,覆蓋主要斷裂點(diǎn)以上的部分bcr基因。因此在正常的間期細(xì)胞中應(yīng)顯示2紅2綠的熒光信號(hào),但由于bcr和abl基因在空間上無(wú)限接近或重疊,會(huì)出現(xiàn)融合信號(hào)的假陽(yáng)性細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道在正常骨髓標(biāo)本中出現(xiàn)此類細(xì)胞的百分比在4%～10%[3-4],本文的閾值為8.56%,在此范圍內(nèi)。本組中ES型bcr/abl探針有很高的檢出率,6例CML初診患者都能檢出bcr/abl融合細(xì)胞,其陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)在69.5%～93%之間,大大高于8.56%的閾值水平。6例中,除了例 10和例15只做了一次FISH外,其他4例都定期用FISH做bcr/abl融合基因的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)例4和例13經(jīng)靶向治療藥物甲磺酸伊馬替尼(格列衛(wèi))治療后,陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)都低于閾值水平,而且和RT-PCR結(jié)果一致。例18初診顯示bcr/abl融合基因陽(yáng)性,經(jīng)格列衛(wèi)治療3個(gè)月后,陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)由85%降至14%,bcr/abl融合基因仍舊陽(yáng)性,說(shuō)明此時(shí)還殘留一定量的白血病細(xì)胞。例22則是復(fù)發(fā)病例,經(jīng)3個(gè)月左右的治療,融合細(xì)胞百分?jǐn)?shù)由78%升高至85.5%,臨床癥狀和其他實(shí)驗(yàn)室檢查也都提示了該病例復(fù)發(fā)。由此可見(jiàn),對(duì)復(fù)發(fā)病例,FISH技術(shù)由于不受細(xì)胞數(shù)量和增殖周期的影響,不僅能輔助診斷CML,而且在監(jiān)測(cè)白血病微小殘留病灶,判斷疾病的進(jìn)展上均有較高的靈敏度。

ES型bcr/abl探針中的9號(hào)染色體9q34,標(biāo)記有紅色熒光,覆蓋整個(gè)abl基因及ass基因,ass為精氨基琥珀酸合成酶的編碼基因,稱為精氨基琥珀酸合成基因,位于第 9q34.1,和 abl基因相距大約200kb,全長(zhǎng)56kb,有13～16個(gè)編碼的外顯子。30%左右的CML患者伴有ass基因缺失,該基因缺失的患者預(yù)后差,慢性期易急變[5]。本組6例初診CML患者首次FISH結(jié)果中僅例22有ass缺失,且ass缺失的比例高達(dá)33%,此后的病程進(jìn)展也證實(shí)了CML伴有 ass基因缺失者慢性期易急變。因此ES型bcr/abl探針可以初步判斷CML患者有無(wú)ass基因缺失及預(yù)后。

綜上所述,FISH技術(shù)在檢測(cè)bcr/abl融合基因方面,對(duì)CML的診斷、格列衛(wèi)治療后病情的監(jiān)測(cè)、ass基因缺失的初步判斷都有明顯的優(yōu)勢(shì),可作為常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)的重要補(bǔ)充。

[1] 張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn).2版.北京:科學(xué)出版社,1998:219

[2] Mitelman F.An International System for Human Cytogenetic Nomenclature In:Mitelman F.Guidelines for cancer cytogenetics.New York:Karger.1995:1

[3] Chase A,Grand F,Zhang Ji Guang,et al.Factors influencing the false positive and negative rates of bcr/abl fluorescence in situ hybridization.Genes Chromosom Cancer,1997,18(3):246

[4] CohenN,Novikov I,Hardan I,et al.Standardization criteria for the detection of BCR/ABL fusion in interphase nuclei of chronic myelogenous leukemia patients by fluorescence in situ hybridization.Cancer Genet Cytogenet,2000,123(2):102

[5] Stephanie A,Smoley,Stephanie R,et al.A novel tricolor,dual-fusion fluorescence in situ hybridization method to detect bcr/abl fusion in cellswith t(9;22)(q34;q11.2)associated with deletion of DNA on the derivative chromosome 9 in chronic myelocytic leukemia.Cancer Genetics and Cytogenetics,2004,148:1