張明五，余運賢，金明娟，潘益峰，姜 俠，李其龍，馬新源，張善春，陳 坤

1.浙江大學公共衛(wèi)生學院流行病學與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善縣腫瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，上海在上世紀80年代初期肺癌發(fā)病率接近日本［1］，在2000年 －2004年期間，上海市女性肺癌的粗發(fā)病率為33.73/10萬，標化發(fā)病率為30.90/10萬，男性的粗發(fā)病率和標化發(fā)病率則分別為81.65/10萬和33.73/10 萬［2］，接近西方國家［3］。肺癌發(fā)病率增加與環(huán)境污染等因素密切相關，同時吸煙也是導致肺癌發(fā)病率不斷上升的重要因素之一。就目前而言，確定肺癌相關的危險或保護因素，篩選合適的易感性分子標志物，對于肺癌的早期預警和預防有重要價值和意義。

microRNAs(miRNA)是一類大小約21－23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結構的約70－90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。這些非編碼小分子RNA(miRNA)參與調控基因表達，miRNA通過與靶基因的mRNA堿基配對引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯［4-5］。研究表明在一些miRNA的編碼基因區(qū)域存在多態(tài)性位點，這些位點可能會對miRNA表達或剪切、成熟過程產(chǎn)生影響，進而影響其對靶基因的調控效應［6］。

研究表明，位于miR-196a2的多態(tài)性位點與肺癌的發(fā)病風險增加顯著相關［7］，而且該位點與肺癌的預后也密切相關［8］。在K-ras的3'端非編碼區(qū)域的let-7結合位點的SNP位點也與肺癌的發(fā)病風險改變有關［9］，這些研究從另外一個側面證實了miRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。本研究試圖探討miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)這2個多態(tài)性位點與肺癌發(fā)病風險的關系;通過檢索miRNA多態(tài)性位點數(shù)據(jù)庫(http://www.patrocles.org/)，未見有關miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)2個多態(tài)性位點與肺癌易感性進行研究的報道。

1 材料方法

1.1 研究對象 采用以人群為基礎的病例對照研究［10］。本研究納入了2002年－2008年期間在浙江省嘉善縣腫瘤研究所報告的244例肺癌病例，病例納入要符合以下標準:①為嘉善縣的本地常住居民;②經(jīng)確診為肺癌患者;③未接受過放療及化療。對照的選擇方法:以年齡(±5歲)、性別和居住地為匹配因素，從同一時期的自然人群對照庫中隨機抽取。所有的研究對象都簽署了知情同意書。采用問卷調查的方式獲取研究對象的基本資料和吸煙、飲酒、喝茶以及性格特征等相關信息。

1.2 標本的收集和處理 采集研究對象外周靜脈血5ml，枸櫞酸鈉抗凝，低溫凍存;參考試劑盒說明書，DNA分離純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)分離純化淋巴細胞DNA;采用核酸定量儀(德國Eppendorf公司)檢測其濃度和純度，調整DNA終質量濃度為100 ng/μl，置低溫冰箱凍存。

1.3 候選基因和SNP位點的選擇 鑒于目前對miRNA功能的研究和報道比較有限，在miRNA 數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)中檢索擬定研究miRNA的靶基因，結合文獻報道對其可能的功能或調控機制的確認，選擇可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關的多態(tài)性位點。同時，在miRNA多態(tài)性位點數(shù)據(jù)庫(http://www.patrocles.org/)選擇多態(tài)性位點在中國人群中的突變頻率 ＞0.05;最后選擇了 miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)2個多態(tài)位點。

1.4 基因型檢測 采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-Restrictedfragmentslength polymorphism，RFLP)技術檢測miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)基因多態(tài)性位點的基因型。在檢測過程中，隨機抽取5%的樣品進行重復檢測，2次檢測結果的一致率為99%以上。

1.5 統(tǒng)計學分析 研究中采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理;其中年齡為連續(xù)變量，采用t檢驗對病例組和對照組的分布進行比較;體重指數(shù)(body mass index，BMI)轉化為(≤24和＞24)分類變量后和性別、職業(yè)等因素，采用χ2檢驗對其分布特征進行比較;采用多因素logistic回歸分析吸煙與肺癌發(fā)病風險的關系時，年齡、性別、BMI、職業(yè)作為協(xié)變量，而在分析多態(tài)性位點與肺癌發(fā)病風險的關系時，以上提到的協(xié)變量加上吸煙、飲酒、飲茶、是否容易生氣作為協(xié)變量納入方程進行分析;同時，以性別和吸煙作為分層變量，探討它們與基因之間對肺癌易感性的交互作用。統(tǒng)計分析均采用雙側檢驗，以α=0.05作為統(tǒng)計學顯著性水平的判斷標準。

2 結果

2.1 研究對象的基本人口學特征 表1顯示，病例組和對照組在年齡、性別、職業(yè)、BMI和教育程度等特征方面，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);但是，病例組的吸煙率(64.8%)明顯高于對照組(51.9%，P＜0.01)。

2.2 吸煙與肺癌發(fā)病風險的關系 在校正了年齡、性別、職業(yè)、BMI后，采用非條件Logistic對行為習慣因素進行分析，結果表明，每天吸煙＜20支者肺癌的發(fā)病風險是不吸煙者的1.7倍(OR=1.7，95%CI:1.0－3.0);每天吸煙20支及以上者的發(fā)病風險增加到4.2倍(OR=4.2，95%CI:2.3 －7.6);飲酒、容易生氣、喝茶等因素與肺癌的發(fā)病風險之間無統(tǒng)計學關聯(lián)(表2)。

2.3 miR-149和miR-605多態(tài)性與肺癌易感性的關系 表3顯示，在校正了年齡、性別、BMI、職業(yè)、吸煙、飲酒、飲茶和容易生氣后，與miR-605 AA基因型攜帶者相比，AG和GG攜帶者的OR分別為1.2(95%CI:0.4－3.4)和1.7(95%CI:0.6－4.8)。將AG和GG基因型合并后，即至少1個G等位基因攜帶者的OR=1.2(95%CI:0.8－1.7)，關聯(lián)均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與miR-149 TT基因型攜帶者相比，CT和TT攜帶者的OR分別為0.7(95%CI:0.3－2.2)和0.6(95%CI:0.2－1.9)，而至少1個C等位基因型攜帶者的OR=0.9(95CI:0.6－1.3);以上關聯(lián)均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.4 性別和吸煙分層后miR-149和miR-605與肺癌的相關性 表4顯示，在吸煙和不吸煙的人群中，miR-605至少1個G(AG+GG)等位基因攜帶者的OR分別為1.4(95%:0.9－2.3)和0.9(95%CI:0.5－1.7)，miR-149至少1個C(CT+CC)等位基因攜帶者的OR分別為0.8(95%CI:0.5－1.3)和1.1(95%CI:0.6－2.0)，關聯(lián)均無統(tǒng)計學意義。

在男性人群中，與miR-605 AA基因型相比，至少1個G等位基因攜帶者的OR分別為1.5(95%CI:1.0－2.3)，P=0.071;而該基因型在女性人群中的OR=0.6(95%CI:0.3－1.4)，P=0.245。在男性人群中，與 miR-149 TT基因型攜帶者相比，至少1個C(CT+CC)等位基因攜帶者的OR=0.9(95%CI:0.6－1.4)和在女性人群中的OR=1.9(95%CI:0.4－1.9)，關聯(lián)均無統(tǒng)計學意義。

表1 研究對象的基本特征Table 1 Distributions of socio-demographic variables among case and control groups

表2 行為習慣因素與肺癌發(fā)病風險的相關性Table 2 Associations of life-style related factors with lung cancer risk

表3 miR-605和miR-149基因多態(tài)性與肺癌易感性的關系Table 3 Associations of miR-605 and miR-149 polymorphisms with lung cancer risk

表4 按吸煙和性別分層后miR-149和miR-605多態(tài)性與肺癌易感性的關系Table 4 Adjusted associations of miR-149 and miR-605 polymorphisms with lung cancer risk after stratification by smoking and sex

3 討論

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性疾病，尋找影響肺癌發(fā)生、發(fā)展的因素對實現(xiàn)肺癌的預防具有重要價值。本研究進一步證實吸煙會明顯增加肺癌的發(fā)病風險，但沒有發(fā)現(xiàn)miR-149多態(tài)性與肺癌的發(fā)病風險之間有統(tǒng)計學關聯(lián);但是，在男性人群中，miR-605突變與肺癌的發(fā)病風險存在一定的關聯(lián)，提示該突變位點可能會增加男性肺癌的發(fā)病風險。另外，本研究沒有發(fā)現(xiàn)吸煙與miR-605和miR-149之間有交互作用。

基于miRNA參與調控基因表達的分子機制，miRNA參與腫瘤易感性改變要滿足2個基本條件:第一，該位點能改變miRNA的表達水平;第二，相關miRNA調控的靶基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本課題組前期對腸黏膜組織的研究結果顯示，該多態(tài)性位點與其成熟miRNA的表達水平有關，提示選擇的這2個位點是有功能的位點。研究表明，miR-149*可以通過調控E2F1和Akt的表達誘導腫瘤細胞的凋亡，該研究證實E2F1和Akt是miR-149的靶基因［11］。而E2F1和 Akt在信號轉導和細胞增殖、凋亡以及分化的調控過程中發(fā)揮重要的作用［12-13］。而本研究則發(fā)現(xiàn)，miR-149基因多態(tài)性與肺癌的發(fā)病風險之間沒有統(tǒng)計學關聯(lián)，與前期在中國人群的另一項研究結果相近［7］。提示miR-149的表達可能具有較強的組織特異性，對于該位點是否會影響miR-149的表達，而最終會影響到哪些基因的表達調控還有待進一步的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-605是P53調控網(wǎng)絡的重要組成部分之一［14］。P53基因除了參與細胞增殖和凋亡調控外，還參與部分miRNAs的表達調控［15］，相互之間形成了有機的調控網(wǎng)絡［16］。miR-605作為調控網(wǎng)絡中的一個分子，其表達異常必然會影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但本研究沒有發(fā)現(xiàn)miR-605編碼基因多態(tài)性與肺癌的發(fā)病風險有關聯(lián)，而關于miR-605在肺癌組織中的表達及其與肺癌的相關性還沒有見到文獻報道，具體的分子機制還有待研究。

本研究按照性別分層分析的結果表明，在男性人群中miR-605的突變基因型與肺癌發(fā)病風險的關聯(lián)有臨界的統(tǒng)計學意義，在女性人群中未發(fā)現(xiàn)類似的結果，提示該位點可能是男性的危險基因型。而結果未達到統(tǒng)計學的顯著性水準可能與樣本量不足有關，尤其是經(jīng)過分層后，進行分析的樣本量限制了統(tǒng)計分析的效率。

除了遺傳因素外，個體行為習慣往往也是影響腫瘤發(fā)病風險的重要因素，本研究沒有發(fā)現(xiàn)飲酒、喝茶和容易生氣等與肺癌的發(fā)病風險有關聯(lián)。而對吸煙行為習慣的分析結果與大量的研究結果類似，本研究表明吸煙頻率增加是肺癌的重要危險因素，相對于不吸煙的人群，隨著吸煙頻率的增加，肺癌的發(fā)病風險將增加1－3倍。該研究結果提示，吸煙可能會導致遺傳損傷的機會和概率增加，進而增加基因乃至細胞突變的機會和概率［17］。

但總體來說該研究還存在以下不足之處:首先樣本量不足可能會對研究結果的穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響;其次，在分析吸煙的危險時因為資料缺陷，沒有分析吸煙的暴露總量對肺癌發(fā)病風險的影響;第三，本研究沒有從組織水平對該多態(tài)性位點的功能性進行確認;第四，本研究采用病例對照研究，對照的選擇可能不當，造成選擇性偏倚。另外，本研究對象對吸煙等變量可能產(chǎn)生回憶性偏倚。以上這些不足都將會對本研究結果或結論產(chǎn)生影響。

［1］SAIKA K，MATSUDA T.Comparison of time trends in lung cancer incidence(1973-97)in East Asia，Europe and USA，from Cancer Incidence in Five Continents Vols IV VIII［J］.Jap J Clin Oncol，2007，37(6):474-476.

［2］LIAO ML，CHEN ZW，ZHENGY，etal.Incidence，time trend，survival，and predictive factors of lung cancer in Shanghai populations［J］.National Medical Journal of China(中華醫(yī)學雜志)，2007，87(27):1876-1880.(in Chinese)

［3］JEMAL A，SIEGEL R，XU J，et al.Cancer statistics，2010 ［J］.Cancer J Clin，2010，60(5):277-300.

［4］DU T，ZAMORE PD.microPrimer:the biogenesis and function of microRNA ［J］.Development(Cambridge，England)，2005，132(21):4645-4652.

［5］LEE Y，JEON K，LEEJT，etal.MicroRNA maturation:stepwise processing and subcellular localization ［J］.The EMBO Journal，2002，21(17):4663-4670.

［6］GOTTWEIN E，CAI X，CULLEN BR.A novel assay for viral microRNA function identifies a single nucleotide polymorphism that affects Drosha processing ［J］.Journal of Virology，2006，80(11):5321-5326.

［7］TIAN T，SHU Y，CHEN J et al.A functional genetic variant in microRNA-196a2 isassociated with increased susceptibility of lung cancer in Chinese［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(4):1183-1187.

［8］HU Z，CHEN J，TIAN T et al.Genetic variants of miRNA sequences and non-small cell lung cancer survival ［J］. The Journal of Clinical Investigation，2008，118(7):2600-2608.

［9］CHIN L J，RATNER E，LENG S et al.A SNP in a let-7 microRNA complementary site in the KRAS 3'untranslated region increases non-small cell lung cancer risk ［J］.Cancer Research，2008，68(20):8535-8540.

［10］LIU B，ZHANG Y，JIN M et al.Association of selected polymorphismsofCCND1，p21，and caspase8 with colorectalcancer risk ［J］.Molecular Carcinogenesis，2010，49(1):75-84.

［11］LIN R J，LIN Y C，YU A L.miR-149* induces apoptosis by inhibiting Akt1 and E2F1 in human cancer cells ［J］.Molecular Carcinogenesis，2010，49(8):719-727.

［12］ZHANG X P，LIU F，WANG W.Coordination between cellcycle progression and cellfate decision bythep53 and E2F1 pathwaysin response to DNA damage［J］.The Journal of Biological Chemistry，2010，285(41):31571-31580.

［13］QI H，F(xiàn)AN L.PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and non-small cell lung cancer［J］.Chinese Journal of Lung Cancer(中國肺癌雜志)，2010，13(12):1149-1154.(in Chinese)

［14］XIAO J，LIN H，LUO X，et al.miR-605 joins p53 network to form a p53:miR-605:Mdm2 positive feedback loop in response to stress［J］.The EMBO Journal，2011，30(3):524-32.

［15］STIK G，LAURENT S，COUPEAU D，et al.A p53-dependent promoter associated with polymorphic tandem repeats controls the expression of a viral transcript encoding clustered microRNAs ［J］.RNA(New York，NY)，2010，16(11):2263-2276.

［16］BOOMINATHAN L.The tumor suppressors p53，p63，and p73 are regulators ofmicroRNA processing complex［J］.Plos One，2010，5(5):e10615.

［17］LEE Y J，SHIM H S，KANG Y A，et al.Dose effect of cigarette smoking on frequency and spectrum of epidermal growth factor receptor gene mutations in Korean patients with non-small cell lung cancer［J］.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，2010，136(12):1937-1944.