徐衛(wèi)華

(浙江省立同德醫(yī)院呼吸科，浙江 杭州 310012)

小動物在一個密封的體積描記箱內(nèi)呼吸，將引起描記箱內(nèi)壓力變化，從而推導出一些小動物的肺功能指標。這些壓力變化主要有兩個來源:吸氣時胸廓膨脹引起的氣體壓縮，以及空氣吸入肺內(nèi)由于溫化和濕化作用，后者使吸入氣體進一步膨脹從而進一步壓縮胸廓外體積描記箱內(nèi)氣體。

在測量小動物肺功能時，除采用整體體積描記法(whole body plethysmography)外，還使用雙室體積描記法(double-chamber plethysmography)或軀體體積描記法(head-out plethysmography)。鑒于小動物呼出的氣體溫度高于描記箱內(nèi)氣體的溫度，可能影響實際測量結(jié)果，有學者在頭室的壁上設置通口，并以固定的流量(500 ml/min)將頭室內(nèi)空氣交換為新鮮空氣，以去除頭室內(nèi)溫度變化的影響。

由于動物體溫高于描記箱內(nèi)的空氣溫度，因此除動物肺內(nèi)的溫化和濕化作用外，在描記箱內(nèi)的空氣亦存在加溫過程。Amdur和Mead觀察了整體體積描記箱內(nèi)動物體溫對箱內(nèi)溫度和壓力變化的影響，但未涉及體積描記箱內(nèi)溫度變化趨勢以及具體變化數(shù)據(jù)。另外，體積描記箱內(nèi)動物呼吸運動時產(chǎn)生的熱量，是否亦對描記箱內(nèi)溫度和壓力產(chǎn)生影響?更重要的是，在壓力型體積描記箱內(nèi)由動物體溫引起的壓力變化是否會影響小動物的呼吸頻率和描記箱內(nèi)壓力變化幅度等問題均未見報道。為此，本研究觀測了放置有小鼠的整體體積描記箱、雙室體積描記箱以及軀體體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化，并研究這些壓力變化對小鼠的呼吸頻率和呼吸幅度的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 本研究使用6－8周齡、體重為18～22 g的雌性BALB/c小鼠(浙江大學實驗動物中心提供)。動物在標準的清潔級飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和進食。所有動物實驗均遵循浙江大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定操作。小鼠在實驗前1 h進入測量實驗室，適應溫度(19.5 ±0.5)℃、濕度為 50%的實驗環(huán)境。對小鼠進行的氣管插管操作，先用1%戊巴比妥鈉以5 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉，再用2 cm長的12G自制氣管插管針對小鼠行氣管插管，外科手術(shù)縫線結(jié)扎固定插管針。實驗結(jié)束后小鼠用超劑量戊巴比妥腹腔注射麻醉處理。

1.2 實驗設備與配置 本研究所使用體積描記箱同文獻所述:呈正方體型，中空體積為(3×4×12)cm，兩個體積描記箱可由小三通管連通成一個雙室體積描記箱，亦可分開成整體體積描記箱或者軀體體積描記箱。每個描記箱均連接一個壓力傳感器，壓力信號由壓力傳感器測量并由Medlab U/4CS系統(tǒng)(南京美易科技貿(mào)易有限公司)處理。基線壓為壓力曲線的基線部分，振幅壓為壓力曲線的振幅部分。

Medlab U/4CS系統(tǒng)工作條件、描記箱內(nèi)壓力和容量的校準換算均與既往研究相同。溫度測量使用科學實驗溫度計(上海華晨醫(yī)學器械有限公司)，精度為0.01℃，測量時該溫度計從蓋板中心孔隙進入描記箱內(nèi)0.5 cm。

1.3 實驗設計 本研究由以下3個實驗組成。

1.3.1 實驗1 小鼠體溫對整體體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化的影響。8只小鼠麻醉后放入整體體積描記箱，記錄小鼠呼吸時描記箱內(nèi)的壓力變化曲線，每分鐘測量1次描記箱內(nèi)的溫度和壓力曲線的基線壓。6 min后將小鼠取出，并予超劑量戊巴比妥腹腔注射將小鼠致死。然后，把死亡小鼠放回到另一整體體積描記箱，再次測量描記箱內(nèi)溫度和壓力變化，每分鐘1次，共測量6 min。

1.3.2 實驗2 小鼠體溫對雙室體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化的影響。8只小鼠按前描述的程序麻醉及氣管插管后，放入雙室體積描記箱的軀體室，插管針連接到描記箱之間的三通管，使其從頭室呼吸。同步測量兩室內(nèi)的溫度和壓力變化。溫度和基線壓每2 min測量1次，共測量20 min。

1.3.3 實驗3 體積描記箱內(nèi)溫度變化所致的壓力變化對小鼠呼吸頻率和壓力變化幅度的影響。兩個相互獨立的軀體體積描記箱，將其中一箱體保持對外密封(密封式軀體體積描記箱)，另一箱體則每2 min內(nèi)對外開放1 min(開放式軀體體積描記箱)。本實驗的小鼠均先進行麻醉和氣管插管，步驟同上。

8只小鼠依次被放入密封式軀體體積描記箱，氣管插管針與描記箱前壁的三通管連接。這樣小鼠從外界呼吸空氣，而軀體在描記箱內(nèi)。小鼠的呼吸頻率和箱內(nèi)壓力變化幅度每2 min測量1次，共測量22 min。

另8只小鼠依次被放入開放式軀體體積描記箱，實驗步驟與密封式軀體體積描記箱的小鼠相同。當兩個描記箱都對外密封時，同步測量小鼠的呼吸頻率和描記箱內(nèi)壓力變化幅度，每2 min記錄1次，連續(xù)22 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，每個指標的數(shù)值以均數(shù)±標準差表示。實驗1、2中的數(shù)據(jù)，采用配對t檢驗比較每個時間點上不同組之間的溫度和壓力變化。實驗3采用隨機區(qū)組方差分析不同時間點及不同小鼠的呼吸頻率和壓力變化。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 整體體積描記箱內(nèi)麻醉小鼠和死亡小鼠引起的溫度及壓力變化 在注入0.2 ml空氣后，體積描記箱內(nèi)壓力迅速上升至1.06 mmHg并保持水平不衰減。圖1A顯示，當麻醉小鼠置于體積描記箱，在6 min內(nèi)箱內(nèi)溫度從(19.94±0.06)℃升高至(21.14±0.20)℃，而死亡小鼠溫度從(19.95±0.04)℃升高至(21.12±0.16)℃。二者引起的溫度升高均大約為1.2℃，且在每分鐘的觀察點，兩組溫度之間均無顯著性差異(P＞0.05)。圖1B顯示，麻醉小鼠引起的體積描記箱內(nèi)基線壓在6 min內(nèi)從0 mmHg升高至(2.710±0.428)mmHg，而死亡小鼠的基線壓增加為(2.671±0.377)mmHg。在每分鐘的觀察點，二者引起的壓力變化均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 整體體積描記箱內(nèi)麻醉小鼠和死亡小鼠引起的溫度和壓力變化曲線Fig.1 Temperature and pressure changes inside whole body plethysmograph generated from anesthetized mice and dead mice

2.2 雙室體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化 軀體室的溫度在20 min內(nèi)從(19.05±0.26)℃增加至(20.97±0.18)℃，在每個時間觀察點上均顯著高于頭室(P＜0.001)，后者從(19.05±0.26)℃升高至(19.14±0.34)℃。其中在14 min的觀察點，軀體室及頭室內(nèi)溫度達到高峰，分別較起始溫度增加2.01℃和0.41℃。在4 min的觀察點，軀體室的溫度較起始溫度增加1.03℃，為溫度升幅最大時間點，升幅達51.32%。軀體室的基線壓，在20 min內(nèi)升高(5.554±0.224)mmHg，在每個時間觀察點上均顯著高于頭室(P＜0.001)，后者20 min升高(0.627±0.552)mmHg(圖2B)。

圖2 頭室和軀體室內(nèi)溫度和壓力變化曲線Fig.2 Temperature and pressure changes inside head chamber and body chamber

2.3 密封室及開放室內(nèi)小鼠呼吸頻率和壓力變化幅度 小鼠放置于密封室內(nèi)，其呼吸頻率由初始的(125.04±22.39)次/min迅速上升至(168.45±36.37)次/min(圖3A)，隨機區(qū)組方差分析的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示在不同的時間觀察點上小鼠的呼吸頻率存在顯著性差異(F=4.751，P＜0.001)。而不同小鼠間隨機區(qū)組因素的F值為26.238，P＜0.001，提示隨機區(qū)組設計良好。小鼠呼吸引起的壓力變化幅度呈逐漸下降趨勢，由最高的(1.090±0.245)mmHg逐漸下降至(0.883±0.168)mmHg(圖3B)。在不同時間觀察點之間亦存在顯著性差異(F=2.535，P=0.009)。不同小鼠間壓力幅度的隨機區(qū)組因素的F值為32.770，P＜0.001，提示隨機區(qū)組設計良好。在開放室內(nèi)，小鼠的呼吸頻率在120次/min左右，最低為(115.74±26.19)次/min，最高為(129.30±40.10)次/min(圖3A)，小鼠的呼吸頻率在不同時間觀察點之間無顯著性統(tǒng)計學差異(F=0.472，P=0.915)。隨機區(qū)組設計數(shù)據(jù)顯示不同小鼠間F值為63.389，P＜0.001，提示隨機區(qū)組設計良好。小鼠呼吸時壓力變化的振幅在1 mmHg左右，最低為(0.980±0.178)mmHg，最高為(1.032±0.231)mmHg(圖3B)，不同時間觀察點間比較無顯著性統(tǒng)計學差異(F=1.396，P=0.192)。隨機區(qū)組設計在壓力幅度的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示不同小鼠間F值為370.964，P＜0.001，提示隨機區(qū)組設計良好。

3 討論

1868 年，Bert首先提出體積描記法概念和操作原理與步驟，并將其用于科學實驗。隨后，經(jīng)學者們進一步改進，使其更適合于小動物呼吸生理的測試。

當用體積描記法測量小鼠的呼吸生理參數(shù)時，假設描記箱內(nèi)的壓力為P，容量為V，吸氣前描記箱內(nèi)溫度為T;假設呼氣后描記箱內(nèi)壓力為P，V為吸入氣體體積，V為呼出氣體體積，T為一次呼吸后描記箱內(nèi)溫度。這樣，在一次呼吸后，根據(jù)玻義耳定律公式:

當 T為 20℃，T是 21℃，而 P為 760 mmHg，則P將可以計算出:

圖3 密封室及開放室內(nèi)小鼠呼吸頻率和壓力幅度變化曲線Fig.3 Changes curve of respiratory frequencies and amplitudes of pressure of mice in the sealed head-out plethysmograph and open head-out plethysmograph

從公式4可知，當溫度升高1℃，描記箱內(nèi)壓力將升高約2.6 mmHg。

體積描記法按照小動物放置的位置不同，可分為整體體積描記法和雙室體積描記法。而按照測試物理原理的不同，又可分為壓力型體積描記法和流量型體積描記法。由于氣體流量信號遠小于壓力信號，對傳感器精確度要求高，因此有不少學者利用壓力型體積描記法進行小動物呼吸生理相關(guān)實驗。

當用壓力型體積描記法測量小動物呼吸生理參數(shù)時，在室溫條件下，由于描記箱內(nèi)空氣低于小動物體溫，動物體表的熱量將輻射至描記箱內(nèi)空氣，因此空氣的溫化過程在動物肺外即體積描記箱內(nèi)也同樣存在。實驗1的結(jié)果顯示，描記箱內(nèi)溫度在實驗開始6 min內(nèi)持續(xù)上升，并使壓力曲線的基線保持同步上升。Lundblad的研究發(fā)現(xiàn)，當用器械撥弄小動物的皮毛使熱量加速釋放時，描記箱內(nèi)壓力加速上升。這說明動物體溫對于動物所在體積描記箱內(nèi)壓力產(chǎn)生顯著影響，與理論部分的方程式推導結(jié)果一致。麻醉動物在體積描記箱內(nèi)，其呼吸運動本身涉及胸廓及腹部的肌肉運動，這些運動將產(chǎn)生熱量。本研究測量并比較了麻醉小鼠和死亡小鼠對于整體體積描記箱內(nèi)溫度和壓力的作用，結(jié)果提示二者均使描記箱內(nèi)溫度上升，數(shù)據(jù)十分接近。死亡小鼠去除了肌肉運動這一影響因素，因此麻醉小鼠所在的體積描記箱內(nèi)溫度變化主要來源于小鼠的體溫，而并非呼吸運動本身。

除體溫因素、呼吸所涉及肌肉運動外，由于小動物呼出氣體的溫度亦高于動物周圍的空氣，故當溫度高的呼出氣體與溫度低的描記箱內(nèi)空氣混合后，將使后者溫度上升，從而導致描記箱內(nèi)壓力上升。實驗2的數(shù)據(jù)顯示頭室內(nèi)溫度及軀體室內(nèi)的溫度均上升，但前者小于后者。有學者使用設備將頭室內(nèi)空氣以固定流量向外抽出并泵入同等流量的外界空氣，使頭室內(nèi)空氣的空氣條件保持與實驗前一致。由于軀體室內(nèi)溫度變化遠高于頭室，因此在使用壓力型雙室體積描記箱測量小動物呼吸生理參數(shù)時，雙向氣流交換更應在軀體室進行而非僅局限于頭室。

本實驗3觀察了密封室內(nèi)小鼠的呼吸頻率及呼吸運動產(chǎn)生的壓力變化幅度，發(fā)現(xiàn)其呼吸頻率在所觀察的22 min內(nèi)逐漸上升，而壓力變化的幅度逐漸下降。同樣的過程在開放室內(nèi)并不存在。開放室定期向大氣開放，室內(nèi)壓力保持與大氣相近，而不是實驗1和2中保持持續(xù)上升趨勢。實驗結(jié)果提示小鼠體溫使箱內(nèi)上升的氣體壓力，能反作用于小鼠的呼吸運動，使其呼吸頻率增加，潮氣量下降。因此，我們在用壓力型體積描記法較長時間內(nèi)測量小動物肺功能，尤其是頻率和潮氣量等數(shù)據(jù)時，必需定期開放描記箱內(nèi)氣體與外界大氣相通，或者直接使用流量型體積描記法測量，以避免升高的基線壓影響測量結(jié)果。

小鼠的體溫顯著影響壓力型整體體積描記箱內(nèi)壓力變化。壓力式雙室體積描記法測量小鼠呼吸生理參數(shù)時，頭室及軀體室的溫度和基線壓力均呈上升趨勢，但前者的變化過程低于后者。而在壓力型體積描記箱內(nèi)，升高的基線壓力反過來作用并影響其中的小鼠的呼吸頻率和潮氣量。

［1］RIBAS-SALGUEIRO J L，MATARREDONA E R，SARMIENTO M，et al.Respiratory response to systemic inhibition of the Na+/H+exchanger type 3 in intact rats ［J］.Respir Physiol Neurobiol，2009，165(2-3):254-260.

［2］AMANO K，F(xiàn)UJII M，ARATA S，et al.DSCAM deficiency causes loss of pre-inspiratory neuron synchroneity and perinatal death ［J］.J Neurosci，2009，29(9):2984-2996.

［3］SOKOLOWSKA B，REKAWEK A，JOZWIK A.Respiratory responses to acute intermittent hypoxia and hypercapnia in awake rats［J］.J Physiol Pharmacol，2008，59(Suppl 6):S659-S667.

［4］HOYMANN H G，WOLLIN L，MULLER M，et al.Effects of the phosphodiesterase type 4 inhibitor roflumilast on early and late allergic response and airway hyperresponsiveness in Aspergillusfumigatus-sensitized mice ［J］.Pharmacology，2009，83(3):188-195.

［5］MITZNER W，TANKERSLEY C.Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998，158(1):340341 .

［6］POLIANSKIJM， BRUN-PASCAUD M C，JELAZKO P R，et al.Ventilation in awake rats with permanent arterial catheters［J］.Comp Biochem Physiol A Comp Physiol，1984，77(2):319-324.

［7］KANAMARU M，HOMMA I.Compensatory airway dilation and additive ventilatory augmentation mediated by dorsomedial medullary 5-hydroxytryptamine 2 receptor activity and hypercapnia［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293(2):R854-860.

［8］AGRAWAL A，RENGARAJAN S，ADLER K B，et al.Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma［J］.J Appl Physiol，2007，102(1):399-405.

［9］FLANDRE T D，LEROY P L，DESMECHT D J.Effect of somatic growth，strain，and sex on doublechamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice［J］.J Appl Physiol，2003，94(3):1129-1136.

［10］AMDUR M O，MEAD J.Mechanics of respiration in unanesthetized guinea pigs［J］.Am J Physiol，1958，192(2):364-368.

［11］HONG W J，SHEN H H，XU W H(洪武軍，沈華浩，徐衛(wèi)華).Relationship between measurements of thoracic inflating volume and tidal volume by pressure plethysmography in mice［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大學學報:醫(yī)學版)，2008，37(3):257-260.(in Chinese)

［12］XU W H(徐衛(wèi)華).Measurement of differential values of inhaled volumes and exhaled volumes in mice.［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大學學報:醫(yī)學版)，2010，39(3):325-328.(in Chinese)

［13］BERT P.Changements de pression de l'air dans la poitrinependantles deux temps de l'acte respiratoire［J］.Cr Soc Biol，1868，20:22-23.

［14］DRORBAUGH J E，F(xiàn)ENN W O.A barometri c method formeasuring ventilation in newborn infants［J］.Pediatrics，1955，16(1):8187 .

［15］EPSTEIN M A，EPSTEIN R A.A theoretical analysis of the barometric method for measurement of tidal volume ［J］.Respir Physiol，1978，32(1):105-120.

［16］OYAMADA Y，MURAI M，HARADA N，et al.Age-dependent involvement of ATP-sensitive potassium channel Kir6.2 in hypoxic ventilatory depression ofmouse ［J］.Respir Physiol Neurobiol，2008，162(1):80-84.

［17］CUMMINGS K J，KALF D，MOORE S，et al.Superoxide dismutase-1 influences the timing and post-hypoxic stability of neonatal breathing［J］.Adv Exp Med Biol，2008，605:133-138.

［18］LUNDBLAD L K，THOMPSON-FIGUEROA J，LECLAIR T， et al. Thoracic gas volume measurementsin paralyzed mice ［J］.Ann Biomed Eng，2004，32(10):1420-1427.