倪 勤，劉 冰，金明娟，馬新源，姚開(kāi)顏，李其龍，陳 坤

(1.浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善縣腫瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

乳腺癌是世界上女性最高發(fā)的惡性腫瘤。少見(jiàn)的高外顯基因BRCA1、BRCA2為乳腺癌的易感基因，但是只有約5% ～10%的乳腺癌發(fā)生歸因于這些易感基因的突變［1］。因而，人群中更為普遍的、低外顯率的弱易感基因可能與內(nèi)源性危險(xiǎn)因素、不良生活方式共同作用，對(duì)散發(fā)性乳腺癌的形成起到促進(jìn)作用。

Caspase級(jí)聯(lián)凋亡通路中的效應(yīng)子有CASP3、CASP6和 CASP7，其中 CASP3是最重要的凋亡效應(yīng)子，與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。而CASP6和CASP7即使被大量消耗，對(duì)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響也相當(dāng)微?。?］。CASP3基因定位于 4q35.1 區(qū)，編碼的前體蛋白含有277個(gè)氨基酸，分子量約32 kD。CASP3前體蛋白在活化過(guò)程中從Asp28～Ser29和Asp175～Ser176兩處被剪切，形成P17(29～175)和P10(182～277)兩個(gè)片段，兩種亞基再組成活性形式的CASP3，隨后則可進(jìn)行下一步的自我催化。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，CASP3基因多態(tài)與肺癌、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤發(fā)病密切相關(guān)［3-8］，但是與乳腺癌易感性的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為了較全面地分析CASP3基因多態(tài)性與乳腺癌的易感性關(guān)聯(lián)，本研究采用Tag SNP的方法選擇單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，以提高關(guān)聯(lián)分析的有效性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 本研究以浙江省嘉善縣為研究現(xiàn)場(chǎng)，采用1∶1匹配的病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)。乳腺癌病例均來(lái)自2005年5月-2008年5月在浙江嘉善縣開(kāi)展的現(xiàn)場(chǎng)病例。根據(jù)當(dāng)?shù)貝盒阅[瘤登記報(bào)告記錄，251例乳腺癌均經(jīng)病理組織學(xué)確診。同時(shí)，按每個(gè)病例同居住地和同年齡(±5歲)的原則，選取健康對(duì)照者。研究對(duì)象共502例，均為女性，且是嘉善永久居民，由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員上門(mén)進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。

1.2 血樣采集及基因組DNA的提取 經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，每一個(gè)體采集靜脈血5 ml，2 ml裝入帶有0.2 ml枸櫞酸鈉的真空小試管，3 ml裝入無(wú)抗凝試劑的真空試管，放入-20℃冰箱保存。儲(chǔ)存樣品于1周內(nèi)送回浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，取枸櫞酸鈉抗凝血1 ml，以RelaxGene血液基因組DNA抽提試劑盒(Tiangen生化科技，北京，中國(guó))抽提全血基因組DNA后，于-20℃冰箱儲(chǔ)存待檢。

1.3 TagSNP的選取 根據(jù) Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hapmap.org)中 CHB(Chinese Han origin in Beijing，中國(guó)漢族)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Haploview軟件進(jìn)行TagSNP的選擇。TagSNP的選取原則:①SNP位于CASP3基因區(qū)域內(nèi);②MAF＞0.05;③TagSNP能代表1個(gè)以上的SNP，且 r2＞0.8。共選取 3 個(gè) TagSNPs，分別為rs4647693、rs2696056 和 rs4647610。

1.4 基因型檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)的方法對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行基因型的檢測(cè)。本研究使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，然后在BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中評(píng)價(jià)引物的特異性，最后在Oligo 6.0軟件中分析引物對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，選取最優(yōu)引物以保證實(shí)驗(yàn)?zāi)芨咝нM(jìn)行。rs4647693位點(diǎn)的上下游引物分別為5'-AATTCTGTTGCCACCTTTCG-3'和5'-ACCTTCTGCGTGTTTGCTC-3';rs2696056位點(diǎn)的上下游引物分別為5'-TTTCCACCAC CACTCTGATA-3'和 5'-ATTATGGCTGTTTCC CTTTT-3';rs4647610位點(diǎn)的上下游引物分別為5'-AACCGCTTGAAGAAATCCTG-3'和5'-ATC TGCCTTGTTGAGCCACT-3'。所有引物均由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系均為20 μl，包括 10 × PCR buffer 2 μl，25 mmol/L MgCl21.6 μl，2 mmol/L dNTPs 2 μl，DMSO 1 μl，10 μmol/L 引物各 0.2 μl，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，約 50 ng 基因組 DNA 0.5 μl，由雙蒸水稀釋至 20 μl。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，在各位點(diǎn)退火溫度(rs4647693:56℃、rs2696056:52℃、rs4647610:57℃)退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)34次，最后72℃延伸5 min。使用的儀器為PTC-200型PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad，USA)。

PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型。酶切總反應(yīng)體系為 8 μl，包括 10×反應(yīng)緩沖液 0.8 μl，10 U/μl限制性?xún)?nèi)切酶 0.3 μl，雙蒸水 1.9 μl，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 5.0 μl。酶切產(chǎn)物經(jīng) 37℃ 水浴6 h后，在2.5%的瓊脂糖凝膠中電泳約20 min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行基因型的判定。限制性?xún)?nèi)切酶Alw26l識(shí)別rs4647693多態(tài)位點(diǎn)，AA基因型產(chǎn)生443 bp 1個(gè)片段，AG 基因型產(chǎn)生443、246、197 bp 3個(gè)片段，GG基因型產(chǎn)生246、197 bp 2個(gè)片段;限制性?xún)?nèi)切酶DdeI識(shí)別rs2696056多態(tài)位點(diǎn)，GG基因型產(chǎn)生139 bp 1個(gè)片段，GC基因型產(chǎn)生139、105、34 bp 3 個(gè)片段，CC 基因型產(chǎn)生 105、34 bp 2個(gè)片段;限制性?xún)?nèi)切酶 HinfI識(shí)別rs4647610多態(tài)位點(diǎn)，AA基因型產(chǎn)生230 bp 1個(gè)片段，AG基因型產(chǎn)生230、178、52 bp 3個(gè)片段，GG基因型產(chǎn)生178、52 bp 2個(gè)片段(圖1～圖3)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用似然比χ2檢驗(yàn)對(duì)照組中的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg(H-W)平衡分析;分類(lèi)變量和連續(xù)性變量在乳腺癌組和對(duì)照組中的分布比較分別采用Pearson χ2檢驗(yàn)和Student-t檢驗(yàn);采用非條件logistic回歸模型計(jì)算表示相對(duì)危險(xiǎn)度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidential interval，CI)，并以年齡、生活方式因素和生理生育因素進(jìn)行校正;采用PHASE軟件對(duì)CASP3單體型進(jìn)行評(píng)估和計(jì)算;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 16.0 for Windows中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般情況分析 乳腺癌組年齡為(54.87±11.20)歲，對(duì)照組年齡為(54.88 ± 11.46)歲，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示兩組間年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以對(duì)照組初潮年齡中位數(shù)(16歲)分組，兩組間初潮年齡分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007);以對(duì)照組初孕年齡中位數(shù)(24歲)分組，兩組間分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002);以對(duì)照組末孕年齡中位數(shù)29歲分組，未發(fā)現(xiàn)兩組間分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其余吸煙、飲酒、飲茶、女性生理生育因素在兩組間的頻率分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1 研究對(duì)象的一般情況Table 1 The distribution of demographic characteristics among cases and controls

2.2 CASP3基因型頻率分布及危險(xiǎn)度分析對(duì)照組中CASP3和CASP9的基因型頻率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，說(shuō)明具有較好的人群代表性。由表2可見(jiàn)，CASP3基因rs4647693多態(tài)性的GG、AG、AA 3種基因型在乳腺癌組中的頻率分布分別為67.87%、28.11%和4.02%;在對(duì)照組中的頻率分布分別為 63.16%、29.96% 和 6.88%;rs2696056 GG、GC、CC 3種基因型在乳腺癌組中的頻率分布分別為 80.00%、19.60% 和 0.40%;在對(duì)照組中的頻率分布分別為82.73%、16.47%和0.80%;rs4647610 AA、AG、GG 3 種基因型在乳腺癌組中的頻率分布分別為51.41%、38.15%和10.44%;在對(duì)照組中的頻率分布分別為51.82%、37.25% 和 10.93%;經(jīng) χ2檢驗(yàn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。經(jīng)過(guò)年齡、吸煙、飲酒等因素調(diào)整后，未發(fā)現(xiàn)CAPSP33 個(gè)SNP與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)。

表2 CASP3 TagSNPs基因多態(tài)與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析Table 2 CASP3 TagSNP polymorphisms and their association with the risk of breast cancer

CASP3單體型分析結(jié)果顯示，GGA是最常見(jiàn)的單體型，其在乳腺癌組和對(duì)照組中分別占66.93%和65.54%，其次為AGG單體型，在乳腺癌組和對(duì)照組中分別占14.74%和16.33%;位居第三的是GCG單體型，在乳腺癌組和對(duì)照組中分別占9.36%和8.57%;其余單體型的構(gòu)成均不足5%。CASP3的單體型在兩組間的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.694，P=0.584)。以單體型GGA作為參照，未發(fā)現(xiàn)其他單體型與乳腺癌遺傳易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(表3)。

表3 CASP3單體型與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)Table 3 CASP3 haplotype frequencies and their association with the risk of breast cancer

3 討論

CASP3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著不可替代的作用。CASP3基因轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞后可引起細(xì)胞凋亡，這個(gè)過(guò)程可以被BCL-2阻斷;但是在發(fā)生凋亡的細(xì)胞提取液中去除CASP3后，這些提取液就失去了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力;再加入純化的CASP3它就又恢復(fù)了致凋亡的功能［9］。多數(shù)的研究表明，腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖和凋亡受抑共同參與了細(xì)胞的累積和腫瘤的形成。CASP3蛋白在多種腫瘤組織呈低表達(dá)［10-13］。研究發(fā)現(xiàn)，CASP3的表達(dá)在乳腺腺病、乳腺纖維腺瘤、乳腺癌中逐漸降低(P=0.000)，并且在乳腺癌中CASP3蛋白表達(dá)率越低，其臨床分期越高(P=0.010)。

Lan等最早報(bào)道了CASP3基因多態(tài)與多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)rs1049216 C等位基因顯著降低多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［5-6］。Jang［7］的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶 CASP3-928A＞G、77G＞A和17532A＞C多態(tài)位點(diǎn)，以及它們單體型的個(gè)體，罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，rs4647601 TT基因型能顯著增加頭頸部癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.32;95%CI=1.00-1.37)［14］。然而，以上四項(xiàng)研究的基因多態(tài)選擇策略均為候選基因選擇策略，對(duì)于CASP3基因多態(tài)性分析不夠全面。Xu［8］等應(yīng)用TagSNP選擇策略挑選SNPs，研究CASP3基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示，rs2705901 CC基因型能顯著增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.25;95%CI=1.03-4.95)。本研究結(jié)果顯示，rs2696056與 rs2705901呈完全連鎖不平衡，但未發(fā)現(xiàn)其與乳腺癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。這可能是本研究樣本量較小，CC基因型的檢出率低。目前針對(duì)CASP3 TagSNP的單體型研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)告;但是，從本研究結(jié)果來(lái)看，單體型的分析結(jié)果與單個(gè)SNP的分析一致，也未發(fā)現(xiàn)單體型與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間存在顯著關(guān)聯(lián)。

綜上所述，基于浙江省嘉善縣開(kāi)展的自然人群為基礎(chǔ)的現(xiàn)場(chǎng)病例對(duì)照研究，未能發(fā)現(xiàn)CASP3的 TagSNPs rs4647693、rs2696056、rs4647610 與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在顯著相關(guān);對(duì)單體型的分析發(fā)現(xiàn)，GGA是最常見(jiàn)的單體型，單體型與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間也不存在關(guān)聯(lián)。

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