朱益民，許玉洋，凌 潔

(浙江大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，浙江 杭州 310058)

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)指人類(lèi)在基因組水平上存在單個(gè)核苷酸變異而產(chǎn)生的DNA序列多態(tài)性。SNP是人類(lèi)最常見(jiàn)的可遺傳變異形式，占人類(lèi)基因組遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP作為第三代遺傳標(biāo)記，廣泛存在于人類(lèi)基因組中，平均每300～600個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)SNP，由此可見(jiàn)人類(lèi)基因組中存在500～1000 千萬(wàn)個(gè)SNP。然而，約有95%SNP位于非編碼區(qū)，稱(chēng)為非編碼SNP(non-coding SNP)，其中位于基因調(diào)控區(qū)的SNP位點(diǎn)稱(chēng)為調(diào)控 SNP(regulation SNP)。存在于基因編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)稱(chēng)為編碼SNP(coding SNP)。在編碼SNP中，若堿基變異不改變所編碼的氨基酸，稱(chēng)為同義 SNP(sense SNP);否則，稱(chēng)為錯(cuò)義 SNP(mis-sense SNP)。另外，有部分堿基變異，導(dǎo)致終止密碼子出現(xiàn)，稱(chēng)為無(wú)義SNP(non-sense SNP)。能引起基因氨基酸序列、轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控、剪接等改變的SNP可能與疾病發(fā)生有關(guān)。在人類(lèi)基因組中，只有部分SNP具有生物學(xué)功能，因此，篩選與疾病相關(guān)的SNP標(biāo)志成為分子遺傳學(xué)和分子流行病學(xué)的重要任務(wù)。在全基因組測(cè)序技術(shù)還不能普及的條件下，限于現(xiàn)有技術(shù)、人力、物力、財(cái)力，目前尚不能對(duì)所有SNP進(jìn)行研究。即便采用SNP芯片也只能檢測(cè)百萬(wàn)左右位點(diǎn)。因此，如何選擇候選SNP成為分子遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析的關(guān)鍵。

在基因組中，SNP不是隨機(jī)分布的。某些SNP位點(diǎn)的等位基因同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)單體型中的次數(shù)多于自由分離重組的期望值，即存在連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)。LD區(qū)可推測(cè)其余SNP在基因組中的分型信息的SNP，稱(chēng)為T(mén)ag SNP。選擇Tag SNP可減少SNP分型數(shù)量。通過(guò)生物信息學(xué)軟件可以預(yù)測(cè)Tag SNP的潛在生物學(xué)功能，具有非同義突變、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和剪接功能等潛在生物學(xué)功能的SNP應(yīng)成為優(yōu)先選擇的位點(diǎn)。我們利用SNP相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和潛在功能軟件，以IGFBP 7為例介紹候選Tag SNP的篩選方法，以供研究者參考。

1 單核苷酸多態(tài)公共數(shù)據(jù)庫(kù)

1.1 單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP)dbSNP是由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)與美國(guó)國(guó)立人類(lèi)基因組研究所(National Human Genome Research Institute)在1998年9月合作構(gòu)建的［1］。數(shù)據(jù)主要來(lái)源有:由人類(lèi)基因組計(jì)劃預(yù)測(cè)得到的SNP，約占65%;私人或研究機(jī)構(gòu)研究者提交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，約占28%。dbSNP收錄了與疾病相關(guān)的突變和中性突變，主要是單核苷酸替換、短的缺失和插入多態(tài);現(xiàn)已擴(kuò)展收錄了微衛(wèi)星重復(fù)和插入缺失多態(tài)。每條記錄都包括突變類(lèi)型、突變點(diǎn)附近DNA序列信息、檢測(cè)該突變點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)條件、出現(xiàn)該突變的群體特征描述及群體基因分型頻率。dbSNP提供在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM的鏈接，可查詢(xún)由遺傳變異引發(fā)的疾病或疾病的致病遺傳變異。dbSNP可廣泛用于研究生物學(xué)問(wèn)題，包括物理定位、功能分析、藥物基因組學(xué)、關(guān)聯(lián)研究及進(jìn)化研究等。

1.2 人類(lèi)基因組單體型圖(haplotype map，HapMap)計(jì)劃 HapMap由美國(guó)、英國(guó)、加拿大、日本、中國(guó)和尼日利亞的科學(xué)家合作完成，目標(biāo)是構(gòu)建人類(lèi)DNA序列中多態(tài)位點(diǎn)的常見(jiàn)模式，運(yùn)用單體型分型方法找出約50萬(wàn)個(gè)Tag SNP來(lái)代替整個(gè)人類(lèi)基因圖譜中的SNP集合，使選出的Tag SNP與表型間的關(guān)聯(lián)更明顯。HapMap收錄了與疾病相關(guān)基因的重要信息，包括:基因型、等位基因頻率、LD等。研究者可通過(guò)染色體位置、基因名稱(chēng)、SNP位點(diǎn)等進(jìn)行相應(yīng)信息的查詢(xún);可根據(jù)研究目的和需要進(jìn)行相應(yīng)的配置設(shè)置，如:人群、r2、MAF等。HapMap已成為人們研究與人類(lèi)疾病、藥物和環(huán)境等相關(guān)基因的重要工具。

1.3 SNP 研究聯(lián)盟(The SNP Consortium，TSC)提供的數(shù)據(jù)庫(kù) TSC是SNP國(guó)際聯(lián)合會(huì)的官方數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了近18萬(wàn)個(gè)SNP數(shù)據(jù)［2］。目標(biāo)是在全基因組范圍內(nèi)尋找30萬(wàn)個(gè)SNP，并將與SNP相關(guān)的信息公之于眾，由之發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)據(jù)也同時(shí)向dbSNP提交。TSC自1999年成立以來(lái)，SNP數(shù)據(jù)量不斷增加，且提供強(qiáng)大的查詢(xún)服務(wù):包括SNP在等位基因中出現(xiàn)的頻率、基因型、SNP定位和連鎖圖譜、SNP檢測(cè)和驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)等。其數(shù)據(jù)主要由斯坦福大學(xué)、華盛頓大學(xué)、Sanger中心及Whitehead研究所這4所測(cè)序中心提供支持和更新，由美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)維護(hù)。

1.4 人類(lèi)基因組突變數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Genome Variation，HGVbase)HGVbase由歐洲生物信息研究所EBI、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室EMBL及瑞典卡羅林研究所聯(lián)合構(gòu)建，主要收錄了DNA多態(tài)和短小的插入、缺失突變。數(shù)據(jù)來(lái)源于文獻(xiàn)、其他數(shù)據(jù)庫(kù)和上述實(shí)驗(yàn)室工作結(jié)果的提交。該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因名稱(chēng)和SNP分別確定了9位數(shù)的ID號(hào)碼。每條記錄包括SNP上下游各25個(gè)核苷酸序列，人群中的等位頻率、編碼區(qū)、啟動(dòng)子和剪接位點(diǎn)，還有GenBank及其他數(shù)據(jù)庫(kù)的鏈接。HGVBase具有易理解和高準(zhǔn)確率的特點(diǎn)，有利于研究者用實(shí)驗(yàn)或生物信息學(xué)方法來(lái)分析基因組突變的結(jié)果［3］。

另外，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院NIH提供的與癌癥和腫瘤相關(guān)候選 SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ipg.nci.nih.gov/)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù) HGMD(http://www.hgmd.cf.no.uk/)、華盛頓大學(xué)按染色體位置組織的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ibc.wustl.edu/snp)、美國(guó)懷特和特研究所建立的人類(lèi) SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.wi.nit.edu/SNP/humHn/index.html)、瑞典卡爾林斯卡研究院建立的數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hgbHse.cgr.ki.se)等都可用于SNP的選擇。

2 SNP位點(diǎn)功能分析工具

現(xiàn)有許多軟件可預(yù)測(cè)SNP變異引起的功能改變，如同義突變、無(wú)義突變、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)節(jié)、剪接位點(diǎn)等。常用的軟件有FastSNP、SNP Function Prediction、F-SNP、HSLS、SNPeffec、SNPinfo、SNPselector、PolyDoms等。

2.1 FastSNP(http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/pages/input_CandidateGeneSearch.jsp)這是一個(gè)對(duì)SNP潛在功能進(jìn)行預(yù)測(cè)的在線軟件［4］。根據(jù)dbSNP、 Ensembl、 TFSearch、PolyPhen、ESEfinder、RescueESE、Genebank 和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)分析的結(jié)果，采用決策樹(shù)(decision tree)方法對(duì)12種SNP引起的功能改變進(jìn)行定量評(píng)價(jià)和危險(xiǎn)度分級(jí)。SNP功能類(lèi)型及相應(yīng)的分級(jí)評(píng)分見(jiàn)表1。根據(jù)危險(xiǎn)度評(píng)分的結(jié)果(0-5)估計(jì)危險(xiǎn)程度高低，供用戶選擇候選SNP位點(diǎn)。危險(xiǎn)度分級(jí)評(píng)價(jià)過(guò)程如圖1所示。FastSNP用UCSC Golden Path和NCBI Blast對(duì)候選SNP進(jìn)行質(zhì)量控制。它基于單體型數(shù)據(jù)庫(kù)HapMap，既獲取SNP的單體型及LD信息，也可進(jìn)一步減少用于分型的候選基因的數(shù)量。

表1 FastSNP軟件預(yù)測(cè)SNPs潛在功能效應(yīng)及其預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)值Table 1 Potential functional effects and risk value predicated by FastSNP

圖1 基于SNP位點(diǎn)的功能效應(yīng)進(jìn)行SNP選擇的決策樹(shù)Fig.1 Decision tree for selecting SNP loci based on the function effects of SNPs

2.2 SNP Function Prediction(http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) 該軟件旨在綜合利用計(jì)算、實(shí)驗(yàn)、流行病學(xué)資料及GWAS的結(jié)果和LD的信息，進(jìn)一步研究遺傳圖譜，篩選SNP位點(diǎn)。用戶可通過(guò)提供一個(gè)或一系列的基因名、基因ID、SNP rsID或者染色體位置等多條途徑進(jìn)行相應(yīng)信息的查詢(xún)。該軟件主要功能:①基于LD、GWAS結(jié)果和SNP功能預(yù)測(cè)信息篩選Tag SNP;②結(jié)合GWAS和LD信息篩選功能性SNP;③LD或基因結(jié)構(gòu)視圖;④預(yù)測(cè)SNP功能，查詢(xún)MAF;⑤DNA序列上SNP信息視圖等。其中SNP潛在功能效應(yīng)有:①轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)SNPs;②外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)SNPs;③miRNA(miRanda)、miRNA(Sanger)SNPs;④nsSNP;⑤終止密碼子SNPs;⑥RegPotential(RP):編碼區(qū) SNPs的 RP Score相對(duì)高，所以常用于編碼區(qū)SNP的篩選。RP Score來(lái)源于UCSC基因生物信息網(wǎng)(http://genome.ucsc.edu/);⑦ Conservation:編 碼 區(qū)SNPs的conservation score相對(duì)更高，所以常用于編碼區(qū)的SNP的篩選，其數(shù)據(jù)也來(lái)源于UCSC基因生物信息網(wǎng)。SNP Function Prediction提供了在11個(gè)人群當(dāng)中的等位基因的頻率。

2.3 F-SNP(The Functional Single Nucleotide Polymorphism) 該軟件提供了16個(gè)與SNP相關(guān)的生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合信息(http://compbio.cs.queensu.ca/F － SNP)，其功能效應(yīng)主要指剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后水平，有助于識(shí)別那些對(duì)人類(lèi)健康有潛在功能效應(yīng)的SNPs［5］。其中識(shí)別非同義SNP的工具有PolyPhen、SNPeffect、SIFT、SNPs3D 和 LS-SNP;識(shí)別外顯子剪切區(qū) SNP的有 ESEfinder、RescueESE、ESRSearch和PESX;識(shí)別無(wú)義突變SNP和內(nèi)含子剪切位點(diǎn)SNP的有Ensembl;在啟動(dòng)子區(qū)識(shí)別轉(zhuǎn)錄調(diào)控SNP的有TFSearch和Consite;識(shí)別在其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(如microRNA，CPG島)SNP的有Ensembl和GoldenPath;識(shí)別翻譯后修飾位點(diǎn)SNP的有KinasePhos、OGPET和 Sulfinator［6］。

F-SNP對(duì)SNP功能評(píng)估程序見(jiàn)圖2。對(duì)每種類(lèi)型采用一系列的測(cè)試以確定該SNP有無(wú)功能效應(yīng)。首先，利用dbSNP和Ensembl確定基因區(qū)域(編碼區(qū)或內(nèi)含子區(qū)等)。確定后繼續(xù)執(zhí)行其他測(cè)試。Ensembl用于檢測(cè)無(wú)義突變，若SNP是錯(cuò)義突變，繼續(xù)用5種不同的工具(PolyPhen、SIFT、SNPeffect、SNPs3D 和 LSSNP)進(jìn)一步測(cè)試以檢測(cè)有無(wú)非同義替換。綜合這些結(jié)果，確定SNP是否具有潛在功能效應(yīng)(在圖中標(biāo)記為‘Functional’)。

另外，HSLS:SNP Function Portal-a數(shù)據(jù)庫(kù)傾向于查詢(xún)蛋白質(zhì)功能效應(yīng)［7-11］。SNPeffect數(shù)據(jù)庫(kù)基于 dbSNP，主要用于查詢(xún) nsSNPs［12-14］。SNPinfo、PolyDoms、SNPselector 等軟件［13，15］都可用于SNP潛在功能的預(yù)測(cè)［16-17］。

圖2 F-SNP中功能評(píng)估的決策程序Fig.2 Decision-making process of functional assessment in F-SNP

3 候選SNP篩選應(yīng)用

3.1 篩選策略 ①基因區(qū)域:IGFBP 7基因上游3000 bp到下游3000 bp區(qū)域;②人種為CHB、CHD、JPT 或 Asia;③用 FastSNP 和 SNP Predication Function等軟件預(yù)測(cè)功能改變類(lèi)型:無(wú)義突變、錯(cuò)義突變、同義突變、剪接調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、microRNA位點(diǎn);④MAF選擇標(biāo)準(zhǔn)≥0.15，如為錯(cuò)義突變、無(wú)義突變和剪接調(diào)控 SNP，MAF 放寬至≥0.05;⑤以 r2≥0.8為標(biāo)準(zhǔn)，選擇TagSNP。

3.2 篩選結(jié)果 依據(jù)上述策略，綜合各功能分析軟件結(jié)果并結(jié)合相關(guān)的GWAS研究以及相關(guān)理論知識(shí)，IGFBP 7基因的候選SNP篩選結(jié)果如下:轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)11個(gè)，內(nèi)含子增強(qiáng)子31個(gè)，內(nèi)含子增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)4個(gè)，剪接位點(diǎn)1個(gè)，共47個(gè)SNPs。另外，還有一些SNP不知道特定人群中MAF，但可能存在潛在功能效應(yīng)的SNP，結(jié)果如下:剪接調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)1個(gè)，剪接調(diào)控1個(gè)，同義突變1個(gè)，剪接調(diào)控和終止密碼子1個(gè)，剪接調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及終止密碼子1個(gè)，同義突變和剪接調(diào)控4個(gè)，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)域10個(gè)，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)域和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)1個(gè)，錯(cuò)義突變(保守)4個(gè)，錯(cuò)義突變(保守)和剪接調(diào)控4個(gè)，錯(cuò)義突變(非保守)和剪接調(diào)控2個(gè)，總共篩選出30個(gè)SNPs。

4 幾個(gè)軟件間的比較

4.1 不同軟件的特點(diǎn)

4.1.1 FastSNP 的優(yōu)點(diǎn)［18-20］①在功能報(bào)告中，提供了用戶檢測(cè)SNPs序列質(zhì)量并驗(yàn)證SNP在人類(lèi)基因組中位置唯一性的按鈕。②整合了UCSC、NCBI及 Ensembl等數(shù)據(jù)庫(kù)。③采用NCBI Blast將SNP序列延長(zhǎng)500 bp，避免了因SNP序列太短而不能設(shè)計(jì)質(zhì)量較好的引物。④提供了來(lái)源于HapMap的單體型數(shù)據(jù)。這樣研究者只需在LD的SNPs中選擇最少的SNPs作為標(biāo)記(如Tag SNPs)來(lái)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，大大減少了基因分型的成本。⑤采用一個(gè)完整的決策樹(shù)對(duì)SNP進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)排序，同時(shí)還考慮了一些之前沒(méi)有考慮的新功能，如由外顯子的跳躍和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的丟失，但FastSNP查詢(xún)時(shí)間較長(zhǎng)。

4.1.2 SNP Function Prediction 既可以篩選TagSNP，又可預(yù)測(cè)SNP的功能效應(yīng)，結(jié)果以可視化圖表顯示，使研究者能夠?qū)Y(jié)果進(jìn)行直觀的分析［6，21-22］。

4.1.3 F-SNP是一個(gè)通過(guò)計(jì)算來(lái)收集關(guān)于SNPs信息的綜合性資源庫(kù)。這些信息來(lái)源于4個(gè)層次:命名、蛋白質(zhì)編碼、剪接調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后調(diào)控。SNP的功能信息隨著其他預(yù)測(cè)工具和生物分子實(shí)驗(yàn)定期更新，整合更多人類(lèi)疾病的數(shù)據(jù)庫(kù)，擴(kuò)大疾病譜，包括常見(jiàn)病和復(fù)雜疾病。F-SNP資源庫(kù)查詢(xún)到的信息較全面，可通過(guò)相應(yīng)的超鏈接獲取所需信息［23-27］。

4.1.4 PolyDoms現(xiàn)有版本不包含SNP位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)復(fù)雜的單倍型等信息，但納入SNP單體型數(shù)據(jù)，這將方便檢索基因型頻率數(shù)據(jù)，選擇關(guān)聯(lián)研究中的Tag SNPs，查看單體型圖形和檢查標(biāo)記間LD模式。

4.2 不同軟件篩選結(jié)果不一致的原因 以FastSNP和SNP Function Prediction 2個(gè)軟件為例進(jìn)行比較。在IGFBP 7的SNPs的篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，前者預(yù)測(cè)有158個(gè)，后者預(yù)測(cè)有117個(gè)，兩者預(yù)測(cè)一致的有51個(gè)(圖3)。結(jié)果存在不一致的主要原因可能是:①2個(gè)軟件評(píng)估方法不同:FastSNP是依據(jù)決策樹(shù)進(jìn)行危險(xiǎn)度分級(jí)，共有12種功能效應(yīng)類(lèi)型，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)從0到5;SNP Function Prediction共有11種功能效應(yīng)類(lèi)型;②FastSNP和SNP Function Prediction這2個(gè)軟件的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具的服務(wù)器有交叉但又有不同，這有可能導(dǎo)致篩選結(jié)果存在交叉，又有所不同。FastSNP提供了8個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具服務(wù)器用于預(yù)測(cè)SNP 的功能效應(yīng):dbSNP、Ensembl、TFSearch、PolyPhen、ESEfinder、RescueESE、NCBI的基因庫(kù)及 Swiss-Prot，使用 UCSC Golden Path及NCBI Blast對(duì)候選SNP進(jìn)行質(zhì)量控制，基于單體型數(shù)據(jù)庫(kù)HapMap以獲取SNP的單體型和LD的信息。SNP Function Prediction基于dbSNP、HapMap、dbGaP、NCBI Entrez Gene、Polyphen、SNPs3D、UCSC等得到SNPs的相關(guān)信息。其他可能的原因有待進(jìn)一步探討。

圖3 FastSNP和SNP Function Prediction 2個(gè)軟件篩選IGFBP 7的SNPs的結(jié)果比較Fig.3 Comparison ofselected SNPsin IGFBP 7 gene between FastSNP and SNP FP

總之，應(yīng)用各種軟件來(lái)選擇功能性SNPs是研究疾病的可遺傳變異的有效方法;當(dāng)然，必須注意的是SNPs僅僅影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性并不是疾病預(yù)測(cè)的充分條件;目前也沒(méi)有1個(gè)工具可以涵蓋所有SNPs可能產(chǎn)生的效應(yīng)，即使是單一的1個(gè)生物學(xué)功能也還不行，所以在選擇SNPs位點(diǎn)時(shí)可以考慮結(jié)合多個(gè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合自己的研究目的選擇合適的SNP位點(diǎn)。

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