孫希潤 梁大勇 田雪梅 宋愛榮

(山東省應用真菌重點實驗室 青島農業(yè)大學,青島 266109)

樺褐孔菌 (Inonotus obliquus)是一種珍稀、名貴的藥用真菌,是前蘇聯(lián)各共和國、波蘭、日本等國的民間常用藥物,現(xiàn)已從其菌核和菌絲中提取到一種具有明顯降血糖作用的糖蛋白 (FIS-1)和另一種水溶性多糖 (F1)。[1～3]樺褐孔菌的人工栽培研究尚處于初級階段,重復性差,距離工業(yè)化或產業(yè)化的路程還十分遙遠。但其菌絲生長快,液體培養(yǎng)的菌絲產量也較高,可以通過開展深層的發(fā)酵培養(yǎng),從菌絲中提取活性物質,具有廣闊的前景。本試驗研究不同碳源、氮源對樺褐孔菌F1菌株菌絲生長及多糖含量的影響,以期為菌株的人工馴化栽培及其菌絲多糖的工廠化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

樺褐孔菌F1菌株,由山東省應用真菌重點實驗室分離鑒定并保藏。

1.2 基礎培養(yǎng)基

①活化母種培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,葡萄糖2%,KH2PO40.1%,MgSO4?7H2O 0.05%,瓊脂2%。②碳源試驗基礎培養(yǎng)基:酵母膏 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4?7H2O 0.05%。③氮源試驗基礎培養(yǎng)基:葡萄糖0.3%,KH2PO40.1%,MgSO4?7H2O 0.05%。

1.3 不同碳源、氮源試驗

在碳源試驗基礎培養(yǎng)基中分別添加含量均為1%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘薯淀粉、玉米淀粉、玉米面(即玉米粉)、乳糖、甘露醇,分別標記為C1～C8,以不另添加碳源的培養(yǎng)基為對照。每種培養(yǎng)基設5個重復。

在氮源試驗基礎培養(yǎng)基中分別添加各種氮源:0.2%NH4HCO3、 0.2%NaNO3、 0.2%NH4NO3、0.6%豆粉、2.1%麩皮、2.6%玉米面、0.4%蛋白胨、0.2%酵母膏,分別標記為N1～N8,以不另添加氮源的培養(yǎng)基為對照。每種培養(yǎng)基設5個重復。

1.4 液體培養(yǎng)方法

在不同碳、氮源培養(yǎng)基中分別接入10 mL液體菌種,在25℃條件下,150 r/min恒溫搖床培養(yǎng),每天定瓶取樣,定時測定其發(fā)酵液的總糖、還原糖、蛋白質的含量及pH值。

1.5 測定方法

①糖含量的測定:采用蒽酮-硫酸比色法測定發(fā)酵液中總糖及還原糖的含量。[4～5]②蛋白質含量測定:采用考馬斯亮藍G-250法測定發(fā)酵液中蛋白質的含量。③菌絲體測定:終止發(fā)酵后,觀察菌球大小、顏色、均勻度,觀察發(fā)酵液的顏色、氣味、澄清度及菌球表面分枝情況;將過濾后的菌絲體置于50℃干燥箱中烘至恒重,用上皿電子天平稱重,并記錄。

2 結果與分析

2.1 碳源利用試驗的結果與分析

(1)液體培養(yǎng)條件下菌球干重的測定。由圖1可以看出,添加葡萄糖的處理C1的菌球干重最大,為2.9199 g/L;添加甘露醇的處理C8次之;其余各處理的干重差別不大;對照處理菌絲體的干重最小,僅為0.3363 g/L。由此可見,F1菌株在液體培養(yǎng)條件下,碳源是其菌絲生長的基本營養(yǎng)要素之一,其中以葡萄糖為碳源的效果最佳。

圖1 菌絲體碳源利用試驗中的菌球干重

(2)液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液多糖含量的測定。試驗結果表明,在不同碳源條件下,各處理多糖含量總體處于先下降后上升的趨勢。添加蔗糖為碳源的處理C2在液體培養(yǎng)的第5天,其發(fā)酵液中的多糖含量達最大值,其他各處理均在第6天出現(xiàn)了多糖含量的最高峰,但是各處理之間的差異較大,其中C1、C3、C4和C5處理的多糖含量較高,均在7 mg/mL左右。C8和CK兩個處理較低,在0～1 mg/mL之間浮動。方差分析表明,C4甘薯淀粉和C1葡萄糖處理的含糖量極顯著高于其他處理 (表1)。

表1 樺褐孔菌F1菌株不同碳源發(fā)酵液在培養(yǎng)第6天的含糖量差異顯著性分析

(3)在液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液pH值的測定。由圖2可以看出,不同碳源條件下,樺褐孔菌F1菌株菌絲體發(fā)酵液的pH變化情況基本一致,起始pH在4～4.5,隨著培養(yǎng)的進行,發(fā)酵液pH呈緩慢上升趨勢,至第8天終止發(fā)酵,發(fā)酵液pH值在5～6之間,前后變化不大。CK處理前4天pH上升明顯,第4天后呈緩慢上升趨勢。其中,C7乳糖處理的pH雖略有上升,但也基本保持在4.5左右。由此可以得出,樺褐孔菌F1菌株在培養(yǎng)過程中會不斷地分泌堿性物質。

圖2 菌絲體碳源利用試驗發(fā)酵液pH變化

(4)液體培養(yǎng)性狀觀察。終止發(fā)酵后,觀察菌球的培養(yǎng)性狀,結果C1、C6、C7處理的菌球表面分枝較長,其余處理分枝較短。C1、C7、C8和CK處理的菌球為褐色,其余處理為米黃色。各處理均具有土腥味。觀察各發(fā)酵液的顏色及澄清度,C1、C8處理的發(fā)酵液為深褐色,C5、C6和C7為土黃色,其余為褐色。其中C1、C2、C8和CK的液體培養(yǎng)基在接種前為澄清,發(fā)酵終止后除CK外,另3個處理的發(fā)酵液仍為澄清。

通過對發(fā)酵液粗多糖含量、發(fā)酵培養(yǎng)性狀和菌球干重等測定得知,在所有供試碳源中,以葡萄糖和地瓜淀粉為最合適。

2.2 氮源利用試驗的結果與分析

圖3 氮源試驗菌球干重/g

(1)液體培養(yǎng)條件下菌球干重的測定。試驗結果顯示,以添加麩皮為氮源的處理N5所測得的菌球干重最大,為9.18 g/L;其次是N6玉米面處理和N4豆粉處理,分別為8.12 g/L和7.56 g/L;以N7蛋白胨為氮源的發(fā)酵液菌球干重最小,為2.96 g/L,CK的菌球干重與N7相近。由此看來,N5、N6、N4對于F1菌株液體培養(yǎng)來說是較好的氮源。

(2)液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液蛋白質含量的測定。樺褐孔菌F1菌株菌絲體發(fā)酵液在整個培養(yǎng)過程中,大多數(shù)處理的蛋白含量變化并不明顯,其中N4處理的變化幅度較大,開始上升緩慢,第10天起上升較快,達到2.54 mg/mL;N5處理的蛋白含量從第6天開始逐漸上升,終止發(fā)酵時為1.46 mg/mL;N1處理的蛋白含量在接種后第2天開始逐漸下降,終止發(fā)酵時僅為0.6 mg/mL。分析蛋白含量的影響因素,認為菌絲體在生長代謝過程中利用培養(yǎng)基中蛋白營養(yǎng)的同時,自身可能產生氨基酸、核酸等蛋白物質,因此在測定過程中不同處理的蛋白含量出現(xiàn)波浪式的變化。

圖4 氮源試驗各處理蛋白質含量

(3)液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液pH值的測定。圖5顯示,不同氮源條件下,樺褐孔菌F1菌株菌絲體發(fā)酵液pH變化不明顯,其中以N6處理的起始pH和終止pH在7～8之間變化,呈弱堿性,其他各處理從發(fā)酵開始到結束,pH值基本保持在4～6之間。從中也表明,樺褐孔菌F1菌株在發(fā)酵過程中不產生酸性物質。

(4)液體培養(yǎng)性狀觀察。發(fā)酵終止后,觀察各處理的菌球培養(yǎng)性狀,菌球顏色多為褐色,有細毛狀分枝;除N2、N3、N5、N8處理的發(fā)酵液混濁外,其余各處理的發(fā)酵液均澄清,多為褐色,具土腥味。

圖5 氮源試驗pH值

根據氮源試驗中蛋白質含量、發(fā)酵液性狀、菌球干重等的綜合分析可知,在所有供試氮源中,蛋白胨是較為理想的。

3 結論

本研究分析比較了樺褐孔菌F1菌株對8種碳源和8種氮源的利用情況,表明以葡萄糖和地瓜淀粉為最佳碳源,以蛋白胨為最佳氮源。因試驗是在單因素條件下進行的,對無機鹽用量、初始pH等多因子的綜合交互效應尚未涉及。

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